胡 軍 ，付 麗 ，王亞茹 ，張 彬 ，劉艷紅 ，賈 棟 ，馬瑞燕

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太谷030801）

蓮草直胸跳甲（Agasicles hygrophila）是全球入侵性雜草喜旱蓮子草的專食性天敵，其已在世界范圍內(nèi)用于防治該惡性雜草[1-2]。目前，生物防治是最有效的防治手段[3]。昆蟲通過觸角辨別不同的氣味實(shí)現(xiàn)定位寄主植物[4]，氣味分子通過自由擴(kuò)散進(jìn)入昆蟲觸角淋巴液后，首先由氣味結(jié)合蛋白（OBP）將其運(yùn)輸并穿過淋巴液，送達(dá)神經(jīng)突觸上的氣味受體（OR），OR在收到氣味分子后，產(chǎn)生神經(jīng)沖動，實(shí)現(xiàn)化學(xué)信號與電信號的轉(zhuǎn)換，并最終引起昆蟲吸引、取食、逃避等行為反應(yīng)[5-6]。因此，OBP能否攜帶特定的氣味物質(zhì)到達(dá)OR是昆蟲能否識別氣味分子的關(guān)鍵。

目前，已有多種昆蟲OBP參與識別植物揮發(fā)物被報(bào)道。其中，草地螟（Loxostege sticticalis）OBP2對植物揮發(fā)性物質(zhì)中含量最高的反式-2-依維派鈉、順式-3-己烯基乙酸鹽有高的親和力和強(qiáng)的電生理反應(yīng)[7]；白背稻虱（Sogatella furcifera）OBP2、OBP11對水稻揮發(fā)物2-十三烷酮、β-紫羅蘭酮有高親和力[8]；苜蓿盲蝽（Adelphocoris lineolatus）OBP10 對6種植物宿主揮發(fā)物月桂烯、β-蒎烯、β-紫羅蘭酮、3- 己酮、（E）-2- 己烯醛、1- 己醇有高的親和力[9]；中華蜜蜂（Apis cerana）OBP2、CSP3對花揮發(fā)物 β-紫羅蘭酮均有高親和力[10]；棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）OBP17、OBP18對多種植物揮發(fā)物尤其是β-紫羅蘭酮有高的親和力[11]；綠盲蝽（Apolygus lucorum）的 3 種 OBP（OBP3、OBP4、OBP6）和一種化學(xué)感受蛋白CSP1對植物揮發(fā)物沒有親和力，但對大部分次生代謝產(chǎn)物均有較高的親和力[12]；樟巢螟（Orthaga achatina）OBP2對植物揮發(fā)物法尼醇和法呢烯有高的親和力[13]；華北大黑鰓金龜?shù)?種OBP（OBP1、OBP2）均對植物揮發(fā)物有高的親和力[14]。

本試驗(yàn)克隆蓮草直胸跳甲OBP51全長cDNA序列，分析其序列特征，并利用定量PCR分析其在成蟲不同組織中的相對表達(dá)量，旨在了解OBP51在蓮草直胸跳甲氣味識別過程中的作用，為進(jìn)一步揭示蓮草直胸跳甲專一取食喜旱蓮子草的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

蓮草直胸跳甲蟲源來自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全與生物防治實(shí)驗(yàn)室長期飼養(yǎng)種群，在人工氣候箱中飼養(yǎng)完成，飼養(yǎng)溫度為25～27℃，光照條件為光照∶黑暗＝14 h∶10 h，濕度為85%。取食的喜旱蓮子草為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全與生物防治實(shí)驗(yàn)室溫室中常年種植。

PhusionRHigh-Fidelity DNA Polymerase購自NEB（伊普斯威奇，英國）；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega（麥迪遜，美國）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.2 OBP51全長基因克隆

表1 研究所用引物

取30頭化蛹3 d的蓮草直胸跳甲成蟲觸角，液氮研磨后用 TRIzol提取總 RNA；取 1 μg總RNA，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA后用PhusionHigh-FidelityDNA Polymerase進(jìn)行全長序列擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為cDNA模板1 μL，5×反應(yīng)緩沖液 4 μL，引物 OBP51-F/R（表 1）各 1 μL，dNTP 0.5 μL，DNA 聚合酶 0.2 μL，去離子水 12.3 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃20 s，35個循環(huán)；72℃5 min。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后進(jìn)行切膠回收，連接到pEASY克隆載體后送至生工公司進(jìn)行測序。測序無誤的單克隆加甘油后保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 OBP51序列分析

使用NCBI的ORF Finder進(jìn)行ORF預(yù)測，使用SignalP 5.0分析信號肽，使用COBALT進(jìn)行多序列比對，使用Compute pI/Mw計(jì)算等電點(diǎn)與分子量，使用ExPASy ProtParm進(jìn)行蛋白質(zhì)理化特性分析，使用PSIPRED預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)[15]；采用Mega 7.0的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，其中，boot strap為1 000次。

1.4 OBP51組織表達(dá)分析

取化蛹后3 d的蓮草直胸跳甲成蟲觸角、頭、胸、腹、后足、翅，分別提取總RNA，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser去基因組并反轉(zhuǎn)后保存于-20℃?zhèn)溆?。使用ABI7500進(jìn)行定量PCR，體系（20 μL）為：2×TBGreenTMPremixExTaqTMII（Tli RNaseH Plus）10 μL，引物 OBP51-qF/qR（表 1）各1 μL，模板1μL。反應(yīng)條件為95℃3min；95℃30s，58℃30 s，72 ℃ 30 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 5 min。60～95℃進(jìn)行融解曲線分析。采用雙ΔCt法計(jì)算OBP51的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 OBP51基因克隆及分析

經(jīng)PCR擴(kuò)增，電泳檢測，得到約400 bp的特異條帶，隨后克隆和測序，獲得OBP51的cDNA全長為 489 bp（圖 1），其中，5′UTR 34 bp，ORF 411 bp，3′UTR 44 bp，編碼 136 個氨基酸；經(jīng) Blast比對，其與多種其他昆蟲OBP均具有高的相似性，其中，與大紅葬甲（Nicrophorus vespilloides）OBP56a最高，為40.52%。初步確定該基因?yàn)闅馕督Y(jié)合蛋白，并命名為AhygOBP51。

2.2 OBP51序列分析

信號肽分析表明，AhygOBP51含有18個氨基酸殘基的信號肽，成熟蛋白為118個氨基酸，分子量為13.06ku，等電點(diǎn)為4.83，為酸性蛋白。含有4個保守的半胱氨酸殘基，缺少Classic OBP特征模式C1X24-29C2X3C3X22-43C4X8-10C5X8C6中的C2和 C5，為 Minus-C 型 OBP。賴氨酸（Lys）、亮氨酸（Leu）、谷氨酸（Glu）、蘇氨酸（Thr）含量均高于 10%，分別為11.9%，11.9%，11.0%和10.2%。不含精氨酸、色氨酸和酪氨酸?？偲骄杷?0.477，不穩(wěn)定系數(shù)40.52，脂肪族氨基酸指數(shù)74.41，表明AhygOBP51為脂溶性疏水蛋白，與氣味結(jié)合蛋白在觸角淋巴液的疏水環(huán)境是相符的。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，主要為α- 螺旋（helix），占 68.6%；其次為無規(guī)則卷曲，占28.8%。其符合氣味結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

2.3 OBP51多序列比對和進(jìn)化分析

將AhygOBP51與其他物種OBPs進(jìn)行多序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖2），除了含有4個保守的半胱氨酸殘基外，在C1與C3之間含有保守的苯丙氨酸（F），C4之后有更加保守的組氨酸（H），推測這些保守的氨基酸殘基可能與其定位或者運(yùn)輸氣味分子的功能密切相關(guān)。

系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示（圖3），雖同為Minus-C型OBP，但被分為4個大分支，AhygOBP51與大紅葬甲（Nicrophorus vespilloides）OBP56a、56d、99a的進(jìn)化距離最近，與食糞金龜（Onthophagus taurus）OBP56d、大蠟螟（Galleria mellonella）OBP56d、葡萄花翅小卷蛾（Lobesia botrana）OBP44等位于同一大分支上。

2.4 OBP51表達(dá)分析

采用定量PCR對OBP51在成蟲不同組織的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果顯示（圖4），在觸角中高表達(dá)，在后足中也高表達(dá)，且雄蟲后足的表達(dá)量高于雌蟲后足。OBP51在不同組織中的表達(dá)量大小為觸角≈后足＞頭＞翅＞胸＞腹。在觸角和后足中的高表達(dá)提示，其除了參與觸角對氣味分子的識別外，可能還參與后足的其他功能。

3 結(jié)論與討論

蓮草直胸跳甲作為入侵性雜草喜旱蓮子草的專食性天敵，在該惡性雜草的生物防治過程中占有重要的地位。本研究克隆得到蓮草直胸跳甲的AhygOBP51，具有4個保守的半胱氨酸殘基，模式符合Minus-COBPs家族的典型特征。Blast分析顯示，編碼蛋白與大紅葬甲（Nicrophorus vespilloides）OBP56a相似性最高，為40.52%；系統(tǒng)進(jìn)化分析也表明，AhygOBP51與大紅葬甲（Nicrophorus vespilloides）OBP56a、56d、99a等聚為一支，表明其親緣關(guān)系較近，可能具有相似的功能。

OBP基因最早被發(fā)現(xiàn)特異性表達(dá)于家蠶觸角中[16]。后來更多的研究發(fā)現(xiàn)，OBPs主要在化學(xué)感受器官中表達(dá)[17]，在翅、足中也表達(dá)。除了觸角，其他組織中也分布有大量的味覺、嗅覺感器，推測可能參與昆蟲對寄主的定位[18-20]。組織表達(dá)分析顯示，AhygOBP51在后足、觸角中高表達(dá)，這可能與昆蟲能高效感受環(huán)境中各種氣味有關(guān)。除了觸角，OBP在足中高表達(dá)也在其他昆蟲中被發(fā)現(xiàn)，如茶尺蠖中多個OBP在足中高表達(dá)[21]；同樣的結(jié)果也在大草蛉[22]、松褐天牛[23]、茄無網(wǎng)蚜[24]中被發(fā)現(xiàn)，推測可能與感知寄主植物非揮發(fā)性物質(zhì)有關(guān)[25-28]，此推測有待進(jìn)一步證實(shí)。

本試驗(yàn)成功克隆了蓮草直胸跳甲OBP51基因，并進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)分析；熒光定量PCR分析顯示，該基因在觸角、足中高表達(dá)，揭示其在蓮草直胸跳甲的化學(xué)感知過程中具有重要功能。后續(xù)擬開展包括RNA干擾、熒光競爭結(jié)合試驗(yàn)等工作深入研究其功能。