賀特 馬云 王五洲 賀俊彥 蔣雨薇 曹旭琴 何淑雅,

1南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 421001；2南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院放射醫(yī)學(xué)教研室，衡陽 421001

輻射與各種化學(xué)物質(zhì)結(jié)合造成的危害是現(xiàn)代生活不可避免的[1]。在日本福島核事故等核災(zāi)難發(fā)生后，由于環(huán)境受到放射性污染，公眾對輻射暴露的健康風(fēng)險越來越關(guān)注。在毒理學(xué)研究中，動物模型被廣泛地應(yīng)用。然而，其成本和許可等問題限制了其在大規(guī)模藥物篩選過程中被使用[2]，為了盡量減少使用高等動物，替代模型變得非常重要。果蠅是一種無脊椎動物，基因組被廣泛研究，且果蠅是一種完全變態(tài)的生物體，其毒性可在胚胎、幼蟲、蛹和成蟲的不同發(fā)育階段表現(xiàn)出來[3]。因此，果蠅適合作為動物模型而應(yīng)用于大規(guī)模藥物篩選。

電離輻射對果蠅的大部分有害影響主要是通過它的間接作用，即通過作用于水分子產(chǎn)生自由基，如羥自由基、超氧陰離子、過氧化氫等，從而使果蠅體內(nèi)各種生物大分子（如 DNA、RNA 和蛋白質(zhì)等）的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，最終導(dǎo)致致命性的細(xì)胞損傷，這是果蠅輻射損傷的主要形式[4]。有研究報道線粒體是細(xì)胞內(nèi)超氧化物產(chǎn)生的主要場所，且同時維生素E在線粒體中的濃度也是最高的，維生素E缺陷型動物的骨骼肌細(xì)胞最早出現(xiàn)的癥狀之一就是線粒體的損壞[5]。線粒體中維生素E的存在對限制超氧化物的生成起著關(guān)鍵作用。維生素E可以通過降低細(xì)胞中線粒體超氧化物的生成、清除已生成的超氧化物和穩(wěn)定線粒體膜，達到降低線粒體超氧化物水平的目的[6]。本研究主要目的是評估維生素E是否能夠提高果蠅幼蟲的抗輻射損傷和抗氧化損傷的能力。鑒于維生素E具有抗氧化作用，確定維生素E是否可以作為哺乳動物的輻射保護劑具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

試劑：3-羥基苯甲酸甲酯（上海生工生物工程有限公司），冰醋酸、無水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀（湖南匯虹試劑有限公司），維生素E（北京博奧拓達科技有限公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物有限公司），過氧化氫酶（catalase，CAT）活力測定試劑盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量測定試劑盒（南京建成生物工程有限公司）。儀器：137Cs γ生物輻照儀（HXFSIA，中國核動力研究設(shè)計院設(shè)備制造廠），Synergy TMHT酶標(biāo)儀（美國BIO-TEK公司），Eppendorf冷凍離心機（德國Eppendorf有限公司），-80℃超低溫冰箱（美國Thermo scientific公司）。

1.2 果蠅幼蟲的培養(yǎng)

W-118野生型果蠅由湖南師范大學(xué)生命科學(xué)院吳秀山教授惠贈。果蠅從胚胎發(fā)育到成蟲大約需要10 d。收集受精的雌性果蠅，產(chǎn)卵限制在4 h，丟棄雌性果蠅，以獲得均勻樣品。卵在培養(yǎng)室中孵育72 h，用20%蔗糖溶液以梯度密度把幼蟲從培養(yǎng)基中分離，獲得第二齡幼蟲。將幼蟲放至裝有蔗糖培養(yǎng)基溶液的玻璃瓶中，備用。

1.3 維生素E處理

在裝有濾紙盤和在10%蔗糖溶液中添加3.5 mL濃度分別為0、100、500、1000、1500 mg/L維生素E溶液，對幼蟲進行24 h處理。每12 h更換一次濾紙，24 h后收獲第三齡幼蟲。

1.4 分組及照射

將培養(yǎng)瓶中的三齡幼蟲分為10組，每組3管，每管100只。將2個5組分別分為對照組和100、500、1000、1500 mg/L維生素E組，其中1個5組放置于生物輻照儀中進行照射，每分鐘輻照劑量約為1.9 Gy，輻照50 Gy；另1個5組不進行照射，將未受照射和照射后的果蠅同時放在25℃的恒溫箱中培養(yǎng)，每5 d更換一次培養(yǎng)基。

1.5 蛹化率和羽化率的測定

每隔6 h觀察照射后幼蟲的形態(tài)變化，以確定蛹化率和羽化率。蛹化率=蛹的總數(shù)/幼蟲數(shù)×100%，羽化率=羽化果蠅的總數(shù)/幼蟲數(shù)×100%。

1.6 羽化后48h死亡率的測定

在幼蟲羽化為成蟲后，每隔12 h觀察其存活數(shù)量直至48 h，以確定死亡率。死亡率=死亡果蠅的總數(shù)/羽化果蠅的總數(shù)×100%。

1.7 果蠅攀爬能力的測定

收集羽化后4～5 d的成蟲，輕拍培養(yǎng)管使果蠅置于培養(yǎng)管底部，果蠅攀爬的運動區(qū)域設(shè)定為培養(yǎng)管底部距頂部棉塞5 cm 之間的區(qū)域，記錄10 s內(nèi)果蠅攀爬到5 cm的百分比。

1.8 氧化應(yīng)激的標(biāo)記檢測

采用生化分析方法對三齡幼蟲的氧化壓力進行評價。每組設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)50只果蠅幼蟲，加入10倍果蠅重量的PBS，在冰上研磨制備幼蟲組織勻漿，4 ℃下3500 r/ min離心（半徑為7.8 cm）15 min，采用 GSH和 CAT試劑盒測定GSH活力和CAT活力。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。果蠅幼蟲的蛹化率、羽化率、CAT 活力、GSH含量和成蟲的攀爬能力、羽化后48 h內(nèi)的死亡率在符合正態(tài)分布的情況下用表示，在方差齊的條件下各組間的比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度維生素E對照射后果蠅幼蟲蛹化率的影響

由圖1可見，在50 Gy γ射線照射后，不同濃度維生素E處理后的果蠅幼蟲的蛹化率與單純照射對照組比較均明顯升高，500、1000、1500 mg/L的維生素E組的蛹化率分別從（43.00±2.00）%增加至 （52.66±2.52）%、（67.00±3.61）%和 （71.33±4.04）%，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；而未受照射的果蠅幼蟲，隨著維生素E濃度的增加，其蛹化率隨之降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 不同濃度維生素E對受照后果蠅幼蟲羽化率的影響

由圖2可見，隨著維生素E濃度的增加，果蠅幼蟲在50 Gy γ射線照射后的羽化率與單純照射的對照組比較明顯增加，分別從（38.36±1.48）%增加至（44.33±2.08）%、（50.00±4.00）%、（62.67±2.08）%、（63.33±3.06）%，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 不同濃度維生素E對γ射線照射后果蠅幼蟲蛹化率的影響 圖中，#：與0 Gy對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.250、6.325、4.427、4.690，均 P＜0.05）；*：與 50 Gy 單純照射對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.209，P=0.006；t=10.082，P=0.001；t=10.883，P=0.000）。對照組為10%蔗糖溶液。Fig.1 Effect of different concentrations of vitamin E on pupation rate of gamma-ray irradiation on drosophila melanogaster larvae

圖2 不同濃度維生素E對γ射線照射后果蠅幼蟲羽化率的影響 圖中，#：與0 Gy對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.942，P=0.042）；*：與50 Gy單純照射的對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.402，P=0.016；t=4.723，P=0.009；t=16.462，P=0.000；t=12.732，P=0.000）。對照組為10%蔗糖溶液。Fig.2 Effects of different concentrations of vitamin E on the eclosion rate of drosophila melanogaster larvae after gamma irradiation

2.3 不同濃度維生素E對受照后果蠅幼蟲48h死亡率的影響

由圖3可見，在50 Gy γ射線照射后，與未照射對照組比較，1000 mg/L和1500 mg/L維生素E組的果蠅幼蟲羽化為成蟲48 h內(nèi)的死亡率分別從（54.0±5.0）% 降低至（36.1±7.6）% 和（37.5±5.8）%，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 不同濃度維生素E對受照果蠅幼蟲攀爬能力的影響

由圖4可見，與單純照射對照組比較，1000 mg/L和 1500 mg/L維生素 E組果蠅幼蟲受照后攀爬能力百分比從（24.33±1.52）%升高至（30.00±2.00）% 和（30.67±3.51）%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 不同濃度維生素E對γ射線照射后果蠅幼蟲48 h死亡率的影響 圖中，*：與50 Gy單純照射的對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.386，P=0.028；t=3.718，P=0.021）。對照組為10%蔗糖溶液。Fig.3 Effects of different concentrations of vitamin E on mortality of drosophila melanogaster larvae at 48 h after gamma irradiation

圖4 不同濃度維生素E對γ射線照射后果蠅幼蟲攀爬能力的影響 圖中，*：與50 Gy單純照射的對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.900，P=0.018；t=2.864，P=0.046）。對照組為10%蔗糖溶液。Fig.4 Effects of different concentrations of vitamin E on climbing ability of fruit fly larvae after gamma-ray irradiation at different doses

2.5 不同濃度維生素E對受照果蠅幼蟲GSH含量的影響

由圖5可見，維生素E濃度分別為500 mg/L、1000 mg/L、1500 mg/L處理的果蠅幼蟲在γ射線照射后GSH含量與單純照射的對照組比較有明顯增加，從（47.43±2.06）μmoL /mg 增加至（57.00±2.70）、（62.8±1.71）、（62.6±2.31）μmoL /mg，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。這說明維生素E可影響受到照射的果蠅幼蟲GSH含量。

2.6 不同濃度維生素E對受照果蠅幼蟲CAT活力的影響

由圖6可見，隨著維生素E濃度從100 mg/L至1500 mg/L的增加，γ射線照射后CAT活力與單純照射對照組比較明顯增加，從（39.70±0.95）U/mg升高至（344.7±1.00）、（47.33±2.72）、（54.43±2.90）、（51.00±3.25）U/mg，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。這說明果蠅幼蟲在受到照射后維生素E可使CAT的含量升高。

3 討論

圖5 不同濃度維生素E對γ射線照射的果蠅幼蟲谷胱甘肽含量的影響 圖中，*：與50 Gy照射的對照組比較，差異均有 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義 （ t=4.911，P=0.008；t=9.955，P=0.001；t=8.611，P=0.001）。對照組為10%蔗糖溶液。Fig.5 Effects of different concentrations of vitamin E on glutathione content in gamma-ray larvae irradiated with different doses of radiation

圖6 不同濃度維生素E對γ射線照射的果蠅幼蟲過氧化氫酶活力的影響 圖中 *：與50 Gy照射的對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.303，P=0.003；t=4.913，P=0.008；t=8.357，P=0.001；t=5.820；P=0.004）。對照組為10%蔗糖溶液。Fig.6 Effects of different concentrations of vitamin E on catalase activity of fly larvae exposed to gamma rays at different doses

近年來，隨著放射治療為基礎(chǔ)的臨床診斷和癌癥放療的增多，輻射對人體的有害程度也有所增加。電離輻射在本質(zhì)上是有害的，會造成間接的DNA損傷。目前，輻射源廣泛應(yīng)用于治療、診斷、能源、戰(zhàn)爭中。核恐怖主義、在外層空間或空中旅行等活動中，利用藥物提高輻射抗性，是保護正常組織不受電離輻射的有害影響的一種方法，特別是那些可以作為自由基清除劑和抗氧化劑的天然來源的化合物，能夠減少或減輕電離輻射帶來的有害影響[7]。

輻射防護劑是一種化合物，具有減少輻射對正常組織的影響，可以降低因電離輻射導(dǎo)致疾病的發(fā)病率和病死率。其在臨床放射治療中也有實際用途，因為正常組織應(yīng)受到保護，防止輻射損傷，大量化合物在體外實驗中表現(xiàn)出良好的放射防護作用，但由于急性毒性和不良反應(yīng)，大部分化合物不適合在體內(nèi)應(yīng)用[3]?；瘜W(xué)物質(zhì)可以通過清除生物體內(nèi)的自由基從而減少DNA鏈斷裂的形成。其可以通過與自由基的反應(yīng)來阻止自由基的形成或破壞自由基，從而抑制自由基與生物體內(nèi)分子的反應(yīng)和輻射暴露時間[8]。真核生物具有減少氧化損傷的抗氧化系統(tǒng)，如限制自由基產(chǎn)生的酶（超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶）。這些物質(zhì)的存在對真核生物的輻射防護具有重要意義[9]。除了酶以外，真核生物還可以通過飲食補充抗氧化劑來防止自由基的破壞，包括維生素A、維生素C、維生素E、多酚、花青素、黃酮類化合物和異硫氰酸酯等，水果、蔬菜和飲料中的化學(xué)物質(zhì)可以通過不同的機制提供細(xì)胞的抗氧化活性[10]。有研究結(jié)果表明，維生素E在提高免疫力、抗氧化、抗腫瘤和癌癥、預(yù)防心血管疾病等領(lǐng)域均具有顯著的作用[11]。

有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高劑量的X射線導(dǎo)致果蠅的蛹化率和羽化率降低，從而抑制果蠅的發(fā)育[12]，果蠅生殖細(xì)胞暴露于X射線和γ射線會誘導(dǎo)致死突變，同時也會干擾活性氧（ROS）的穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致活性氧的過度產(chǎn)生，從而導(dǎo)致DNA損傷[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，果蠅幼蟲在受到照射后蛹化率和羽化率、攀爬能力均降低，羽化后48 h的死亡率升高，體內(nèi)GSH含量和CAT活力減少，與之前的研究結(jié)果相符[12-14]。這表明γ射線輻照誘發(fā)的自由基氧化損傷機制可能是通過降低果蠅體內(nèi)抗氧化酶活力和非酶組分等增加了活性氧和脂質(zhì)過氧化物的生成，使氧化損傷不斷加劇，從而影響果蠅抵抗氧化損傷的能力，造成果蠅蛹化率和羽化率的下降、死亡率的上升。對于未受到照射的果蠅，維生素E組與對照組的GSH含量和CAT活力相比較沒有顯著的變化，造成此現(xiàn)象的原因可能是本研究選取的實驗對象與其他文獻報道的不同，其次因為果蠅在不同的生長發(fā)育時期各種蛋白的表達可能具有時空性，故其潛在的機制還需進一步的研究。本研究結(jié)果表明，維生素E預(yù)處理可以緩解高劑量輻射對果蠅造成的氧化應(yīng)激和DNA損傷，提高受照后果蠅幼蟲的蛹化率和羽化率，維生素E通過減輕氧化應(yīng)激從而改善果蠅的抗輻射能力，驗證了維生素E具有輻射防護作用。本研究為輻射防護劑的研發(fā)提供了參考。