陳麗，焦健，朱紹丹，李朝周

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點實驗室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅 蘭州 730070)

NaCl脅迫是植物生長過程中所面臨的重要環(huán)境脅迫之一，對我國乃至世界范圍內(nèi)的農(nóng)業(yè)存在著廣泛而巨大的制約，據(jù)聯(lián)合國教科文組織(UNESCO)和糧農(nóng)組織(FAO)不完全統(tǒng)計，全世界鹽漬土面積約10億hm2，而我國鹽漬土面積占約1億hm2[1-2].研究表明NaCl脅迫會影響植物生長、光合作用、蛋白合成、能量和脂類代謝等過程，土壤溶液中鹽分過量會對植物造成滲透脅迫、離子毒害、營養(yǎng)失衡和氧化脅迫等方面的傷害，最終導(dǎo)致植物光合速率、生物量下降，生長受到抑制，甚至死亡[3-5].鹽漬環(huán)境下植物根區(qū)鹽分與養(yǎng)分元素之間的協(xié)同或拮抗作用，可能加強或減弱鹽分對植物生長和養(yǎng)分吸收的影響程度，從而對植物耐鹽性產(chǎn)生影響[6].

鈷是土壤及地殼的一種微量元素，通常被認(rèn)為是植物的有益元素，近年來研究證明它是維生素 B12的主要成分，參與豆科植物根瘤菌的固氮作用、核酸、蛋白質(zhì)、能量代謝、促進植物的增產(chǎn)，也是人和動物體內(nèi)必備的微量元素之一[ 7-8].另外，適宜濃度的鈷有利于種子萌發(fā)、幼苗生長、葉綠素的合成以及光合作用[9-10].因此，開展鈷對植物生長發(fā)育的相關(guān)研究，對改進植物的品質(zhì)，提高作物對外界不良因素的抵抗力有一定的意義.

蠶豆(ViciafabaL)是我國重要的豆科植物，其產(chǎn)量占世界第一位.中國蠶豆的主要產(chǎn)區(qū)在西北地區(qū)，而西北地區(qū)土地鹽漬化比較嚴(yán)重，因此探討脅迫條件對蠶豆生長的影響,將有利于抗鹽堿作物新品種的引種和繁育[4].李朝周等[11]研究發(fā)現(xiàn)，CoCl2顯著減輕了鹽脅迫下苜蓿幼苗葉片多胺氧化酶活性升高、多胺含量下降及脂質(zhì)過氧化程度的增加，減緩了細(xì)胞膜穩(wěn)定指數(shù)的下降，從而表現(xiàn)出一定的保護作用.王建寶等[12]研究表明，低濃度鈷可以誘導(dǎo)蠶豆中抗氧化酶活性增強，促進其葉片光合色素含量、光合作用效率提高和植株生長發(fā)育，而高濃度鈷則表現(xiàn)出相反趨勢，抑制蠶豆的光合效率和生長發(fā)育.對于在NaCl脅迫環(huán)境下，CoCl2對蠶豆種子和幼苗生長的影響國內(nèi)外研究尚不多見，因此我們試圖通過施加不同濃度CoCl2，研究NaCl鹽脅迫下蠶豆種子萌發(fā)及幼苗生長，探求較適合蠶豆生長的CoCl2濃度范圍，為鈷鹽在鹽堿地農(nóng)作物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料蠶豆品種為‘臨蠶5號’，由甘肅省農(nóng)科院提供種子，試驗于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)林木種苗培養(yǎng)室內(nèi)進行，室內(nèi)溫度為(20±5)℃.

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 種子發(fā)芽試驗 試驗設(shè)置CoCl2濃度為：CK(0)、0.002、0.004、0.006、0.008、0.1、0.012、0.014、0.1、1和10 mmol/L(序號分別T1～T11)，選大小一致且飽滿的蠶豆種子，用0.1% HgCl2溶液消毒10 min，蒸餾水漂洗后用蒸餾水浸泡12 h使種皮軟化，浸種后的種子每10粒整齊鋪入直徑120 mm雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，并將培養(yǎng)皿置于溫度為20 ℃，相對濕度為80%的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，8 h光照，光照強度為500 μmol/(m2·s)，16 h黑暗.每日用對應(yīng)濃度的CoCl2的Hoagland營養(yǎng)液澆灌種子2次，每次6 mL，并記錄發(fā)芽數(shù)(以胚芽長度超過種子一半為種子發(fā)芽的判斷標(biāo)準(zhǔn)).以上處理均重復(fù)3次，在發(fā)芽后測胚芽、胚根長，發(fā)芽數(shù)以計算相對胚芽長，相對胚根長，發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，以確定適宜的CoCl2濃度范圍后，進行盆栽NaCl脅迫試驗.

1.2.2 NaCl脅迫下幼苗生長盆栽試驗 試驗設(shè)置4 個CoCl2溶液濃度梯度(發(fā)芽試驗確定的適宜濃度范圍)：CK(0)、0.004、0.008、1 mmol/L.挑選籽粒飽滿，無病斑的蠶豆種子，用自來水浸泡1 d，使種皮軟化.挑選露白一致的萌發(fā)種子均勻播種于直徑為15 cm，深度為20 cm裝有營養(yǎng)土的塑料花盆中，每盆為20粒，每日用對應(yīng)CoCl2濃度的Hoagland營養(yǎng)液澆灌100 mL.待幼苗長至第四片真葉完全展開時，開始進行NaCl脅迫處理，設(shè)CK(0)、0.2、0.4和0.6 mol/L 4個NaCl脅迫處理，每處理組3次重復(fù)，分別用注射器在其根頸部將每組對應(yīng)NaCl溶液緩慢注入，每盆50 mL，CK加入等量蒸餾水.脅迫處理21 d后，測定蠶豆幼苗株高、基徑、葉長、葉寬、葉面積、葉綠素含量、地上部分與地下部分生物量.

1.2.3 相關(guān)指標(biāo)測定及統(tǒng)計方法

發(fā)芽率(%)=發(fā)芽種子數(shù)/試樣粒數(shù)×100%

相對胚芽長(%)=處理胚芽長/對照胚芽長×100%

相對胚根長(%)=處理胚根長/對照胚根長×100%

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt)(Gt為t時間的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù))

活力指數(shù)(VI)=GI×S(GI為發(fā)芽指數(shù)，S為幼苗生長勢，指萌發(fā)后的幼株高(胚根長和胚芽長)

葉長和葉寬均由游標(biāo)卡尺測量，葉長為葉枕到葉尖的距離，葉寬為葉片中部最寬處的長度.

葉面積=葉長×葉寬×0.71[13]

葉綠素含量(Chlorophyll)測定采用Lichtenthaler[14]的方法.

將植株分為地上部分和地下部分，用電子天平稱量植株鮮質(zhì)量；再將其置于105 ℃的烘箱中殺青1 h，后置于65 ℃恒溫下烘48 h，冷卻后稱量植株干質(zhì)量.

R/C=地下部分干質(zhì)量/地上部分干質(zhì)量

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理，統(tǒng)計分析和制圖，并用Duncan法進行差異顯著性分析(P<0.05).

2 結(jié)果與分析

2.1 CoCl2對蠶豆種子萌發(fā)的影響

表1結(jié)果顯示，CoCl2對蠶豆種子的萌發(fā)具有顯著影響.隨著CoCl2濃度增大，蠶豆種子發(fā)芽率、相對胚芽長、相對胚根長、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均呈先增后減的趨勢.在CoCl2濃度小于0.008 mmol/L時，蠶豆種子的發(fā)芽率、相對胚芽長、相對胚根長、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均顯著高于對照(P<0.05)，分別達到40%、46%、20%、40%、84%.CoCl2濃度為0.1～10 mmol/L時，各項指標(biāo)遠低于T5處理，種子出現(xiàn)了壞種、中毒現(xiàn)象，同時爛根情況也有所增加.以上結(jié)果表明，0.008 mmol/L CoCl2有利于促進種子萌發(fā)，較高濃度則表現(xiàn)出抑制作用.

表1 CoCl2對蠶豆種子萌發(fā)的影響

2.2 CoCl2對NaCl脅迫下蠶豆幼苗生長的影響

2.2.1 株高和基徑 由圖1可以看出，相同CoCl2處理下，蠶豆幼苗株高和基徑隨NaCl脅迫的加劇呈不同程度的降低趨勢.0.008 mmol/L CoCl2處理下，株高相比CK在0.6 mol/L NaCl脅迫時降至22.22%，基徑變化較??；高濃度CoCl2(1 mmol/L)處理組在不同NaCl脅迫下，株高的增幅由1%降至-42.47%；基徑由-21%降至-26%.在相同NaCl脅迫下，隨著CoCl2濃度的升高，蠶豆幼苗株高和基徑基本呈單峰型曲線變化，0.004和0.008 mmol/L CoCl2處理顯著(P<0.05)提高了蠶豆幼苗株高和基徑(圖1)，且在0.6 mol/L NaCl脅迫下，株高較CK組增加了40%、60%，基徑增加了5%、22%.表明0.008 mmol/L CoCl2處理顯著緩解了NaCl脅迫對蠶豆幼苗的株高和基徑生長的抑制，這一現(xiàn)象在重度NaCl脅迫下更明顯.

不同小寫字母表示同一CoCl2濃度下不同NaCl處理與對照相比有顯著差異(P<0.05)；*表示同一NaCl處理下CoCl2濃度升高與對照相比有顯著差異(P<0.05).Different lowercases indicate significant difference between NaCl treatment within the same CoCl2 concentration compared with control(P<0.05).* indicates significant difference between higher CoCl2 concentration and ambient CoCl2 level within the same NaCl treatment (P<0.05).圖1 CoCl2 對NaCl脅迫下蠶豆幼苗株高和基徑的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，n=3)Figure 1 Effects of CoCl2 on plant height and base diameter of Vicia faba seedlings under NaCl stress(mean±SE,n=3)

2.2.2 葉片形態(tài) 由圖2可見，不同CoCl2處理下的蠶豆幼苗葉長、葉寬和葉面積隨NaCl脅迫加劇均呈降低趨勢，葉面積變化差異最顯著(P<0.05).隨著NaCl脅迫增加，相比CK，0.008 mmol/L CoCl2處理的葉長、葉寬和葉面積降低幅度明顯低于其余CoCl2處理，在重度NaCl脅迫下分別降低了16%、24%和46%.說明，較低濃度的CoCl2處理可通過改變?nèi)~片形態(tài)來緩解鹽害，提高植物的抗鹽性，而高濃度CoCl2處理則對蠶豆葉片生長有抑制作用.在相同NaCl脅迫條件下，蠶豆幼苗葉長、葉寬和葉面積隨著CoCl2濃度的升高，均呈現(xiàn)單峰型曲線變化，在CoCl2為0.008 mmol/L時達到最大.重度NaCl脅迫下， 0.008 mmol/L CoCl2處理組葉長、葉寬、葉面積對比CK分別增長了62%、39%和125%，表明重度鹽脅迫下，0.008 mmol/L CoCl2對幼苗葉片生長有顯著促進作用(P<0.05)，但作用幅度存在一定差異.

2.2.3 葉綠素含量 如圖3所示，隨NaCl鹽脅迫的加劇，施加較低濃度的CoCl2可以緩解葉綠素含量的下降，0.008 mmol/L CoCl2緩解的效果最為顯著，重度NaCl脅迫葉綠素含量相比CK降幅分別為Chl a為14%；Chl b為5%；Chl(a+b)為7%，Chl a /Chl b為9%.而高濃度CoCl2(1 mmol/L)處理組蠶豆幼苗葉片葉綠素含量的變化趨勢總體呈下降趨勢，與CK基本一致，對NaCl脅迫緩解作用減弱，且在重度NaCl脅迫下葉綠素含量顯著降低(P<0.05)，體現(xiàn)出一定的毒害作用.

在相同NaCl脅迫下，隨著CoCl2濃度的升高，蠶豆幼苗葉片葉綠素含量主要表現(xiàn)為低濃度促進高濃度抑制效應(yīng)，并在CoCl2濃度0.008 mmol/L時達到最大值，且顯著高于CK和其余處理組(P<0.05).0.6 mol/L NaCl脅迫下，各葉綠素含量在不同CoCl2(0.004、0.008、1 mmol/L)濃度下與CK組對比變化幅度分別為：Chl a為45%、62%、-2%；Chl b為34%、41%和-12%；Chl(a+b)為39%、48%和-29%；Chl a/Chl b為8%、15%和11%.這表明，重度鹽脅迫下，0.008 mmol/L CoCl2處理能顯著促進蠶豆幼苗葉片葉綠素光合色素的合成，而高CoCl2濃度則顯著抑制葉片葉綠素合成或者促進其降解.

不同小寫字母表示同一CoCl2濃度下不同NaCl處理與對照相比有顯著差異(P<0.05)；*表示同一NaCl處理下CoCl2濃度升高與對照相比有顯著差異(P<0.05).Different lowercases indicate significant difference between NaCl treatment within the same CoCl2 concentration compared with control(P<0.05).* indicates significant difference between higher CoCl2 concentration and ambient CoCl2 level within the same NaCl treatment (P<0.05).圖2 CoCl2 對NaCl脅迫下蠶豆幼苗葉片形態(tài)的影響Figure 2 Effects of CoCl2 on leaf morphology of Vicia faba seedlings under NaCl stress

2.2.4 地上部分及地下部分(根系)干質(zhì)量 如圖4所示，隨著NaCl脅迫加劇，0.008 mmol/L CoCl2處理組生物量相比其余CoCl2處理組降低幅度較小，地上部分干質(zhì)量呈下降趨勢，地下部分干質(zhì)量和R/C則呈現(xiàn)先增后減的趨勢，在重度(0.6 mol/L)NaCl下，地上部分干質(zhì)量低于CK 20%；地下部分干質(zhì)量低于CK 9%；R/C則高于CK 18%.0.6 mol/L NaCl脅迫下，1 mmol/L CoCl2處理組，比0.008 mmol/L CoCl2處理組地上部分干質(zhì)量減少29%；地下部分干質(zhì)量降低44%；R/C降低22%.說明蠶豆幼苗的生物量隨著NaCl濃度增加而降低，而適當(dāng)濃度CoCl2可緩解鹽脅迫的傷害，提高蠶豆的生物量，且在0.008 mmol/L時保護效果較好；各處理組地上部分與地下部分生物量變化不同步，存在一定差異.

相同NaCl脅迫下， 0.4 mol/L、0.6 mol/L NaCl處理蠶豆幼苗的地上干質(zhì)量和地下干質(zhì)量隨著CoCl2濃度升高而總體呈現(xiàn)先增后減的趨勢，且地上部分干質(zhì)量比地下部分干質(zhì)量變化顯著，R/C變化趨勢則與地上部分干質(zhì)量相反.0.6 mol/L NaCl處理下,對比CK,蠶豆幼苗的地上部分干質(zhì)量、地下部分干質(zhì)量和R/C在不同CoCl2(0.004、0.008、1 mmol/L)濃度下變化幅度分別為：地上部分干質(zhì)量為6.32%、31.84%、和-5.79%；地下部分干質(zhì)量為73.91%、78.26%、-0.87%；R/C為63.58%、35.21%和5.22%.這表明，重度NaCl脅迫下，0.008 mmol/L CoCl2可以促進蠶豆幼苗地上部分，尤其顯著促進地下部分生物量的累積，顯著提高R/C(P<0.05)，增強幼苗的抗鹽性，較高濃度的CoCl2則會加強鹽脅迫的危害.

3 討論與結(jié)論

植物對外界環(huán)境最直接的反應(yīng)是在種子萌發(fā)期及幼苗生長期，植物萌發(fā)期的狀態(tài)會對幼苗生長期的生長及生物量造成嚴(yán)重的影響，決定著作物的生長以及產(chǎn)量[15].有研究表明，鈷元素對一些植物有促進的作用，且能緩解在逆境下對植物的傷害作用[16]，如甘草、苜蓿[8,11]、玉米及小麥[9,17]等，且出現(xiàn)了“低促高抑”的現(xiàn)象[18].本研究的蠶豆種子發(fā)芽試驗結(jié)果與前人研究基本一致，表現(xiàn)為隨著CoCl2的濃度增加，蠶豆種子的發(fā)芽率，胚芽胚根長，發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)都呈顯著的先增后減的趨勢，且以低濃度0.008 mmol/L CoCl2有利于促進種子萌發(fā).在NaCl脅迫下，較低濃度的CoCl2對增強植株的抗鹽性有一定的作用，但濃度高于1 mmol/L時則會抑制幼苗生長，加速植株的衰老過程.

不同小寫字母表示同一CoCl2濃度下不同NaCl處理與對照相比有顯著差異(P<0.05)；*表示同一NaCl處理下CoCl2濃度升高與對照相比有顯著差異(P<0.05).Different lowercases indicate significant difference between NaCl treatment within the same CoCl2 concentration compared with control(P<0.05).* indicates significant difference between higher CoCl2 concentration and ambient CoCl2 level within the same NaCl treatment (P<0.05).圖4 CoCl2 對NaCl脅迫下蠶豆幼苗地上部分與地下部分干質(zhì)量的影響Figure 4 Effects of CoCl2 on ground and underground dry weight of Vicia faba seedlings under NaCl stress

植物通過葉綠素進行光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化，同時葉綠素含量也是植物受傷害程度的重要標(biāo)志[2].本研究表明，葉綠素含量在輕度NaCl脅迫下無刺激增長，且隨脅迫加劇而顯著下降，這與前人的研究結(jié)果稍有差異，即低濃度鹽堿脅迫能刺激葉綠素合成，高濃度則會使葉綠素合成受阻，導(dǎo)致葉綠素含量下降，進而影響植物的光合作用能力，使得植物對抵抗外界環(huán)境的能力降低[5,19-20]；施加 0.008 mmol/L CoCl2處理促進蠶豆幼苗Chl a、Chl b和Chl( a+ b)含量升高，表現(xiàn)出了低劑量的刺激效應(yīng)，說明低濃度的鈷能維持NaCl脅迫下蠶豆葉片有較高的葉綠素含量，從而增加葉片的光合性能，對NaCl脅迫下葉綠素的降低起到一定的緩解作用[12].1 mmol/L CoCl2處理顯著降低其含量；而 Chl a/Chl b在1 mmol/L CoCl2時卻升高，由于在NaCl脅迫下，Chl a的下降明顯高于Chl b，導(dǎo)致Chl a/Chl b增加，且Chl a(藍綠色)的累積速度高于Chl b(黃綠色)的累積速度，莖葉顏色變暗，這與試驗中觀測的顏色基本一致.由此表明，低濃度的CoCl2溶液可增強蠶豆幼苗合成葉綠素的能力，從而表現(xiàn)出顯著的保護作用[17-18]，且適當(dāng)濃度CoCl2處理能夠促進蠶豆幼苗葉綠素的生物合成,保護植物組織的光合作用，從而減輕NaCl脅迫的毒害,維持蠶豆幼苗正常生長發(fā)育.

生物量是植物對NaCl脅迫反應(yīng)的綜合體現(xiàn)，即對NaCl脅迫的綜合適應(yīng)，也是植物耐鹽性的直接指標(biāo)[21].本研究表明，蠶豆幼苗地上與地下部分生物量隨NaCl脅迫增大而降低，這與前人的研究結(jié)果較為一致[22-23]，0.008 mmol/L CoCl2明顯減緩了鹽脅迫對地上部分干質(zhì)量與地下部分干質(zhì)量的危害，使R/C顯著提高，大量研究表明，根冠比R/C值的增大有利于提高植物對水分的利用率，是作物對鹽的一種適應(yīng)，在鹽脅迫下植物根系生長的敏感性要低于地上部分，使得根冠比R/C會增加[20,22].因此，NaCl脅迫下施加較低濃度的CoCl2溶液，更有利于蠶豆幼苗生物量的積累和根系的縱深發(fā)展，同時提高對土壤深層水分的利用率.

綜合結(jié)果表明，低濃度CoCl2對蠶豆幼苗的發(fā)芽率、相對胚芽長、相對胚根長、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)有顯著的促進作用，而高濃度則相反.NaCl脅迫下，低濃度CoCl2溶液(小于1 mmol/L)對蠶豆幼苗株高、葉長、葉綠素含量、地下部分生物量有一定的促進作用，可增強植株的抗鹽性，且以CoCl2濃度為0.008 mmol/L時表現(xiàn)較為突出，而高濃度CoCl2溶液(大于1 mmol/L)會抑制其生長，且對蠶豆毒害作用較大.因此，可通過噴施低濃度Co2+溶液增強蠶豆在鹽區(qū)適應(yīng)性，從而有助于蠶豆產(chǎn)量提高.