隋馨瑤，孫二娜，王瑩，趙亮,3，孫健，牛天驕，張明，文鵬程

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；3.河北省畜產(chǎn)食品工程技術(shù)研究中心，河北 三河 065200；4.蒙牛高科乳制品(北京)有限責(zé)任公司，北京 101107；5.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100048)

航天誘變技術(shù)就是利用返回式衛(wèi)星搭載，將生物材料帶入太空，在太空特殊的環(huán)境下，對(duì)種子進(jìn)行多項(xiàng)誘變處理，改變種子的基因，從中篩選有益突變，獲得新品種[1].近幾年，我國(guó)已經(jīng)開(kāi)始利用航天誘變技術(shù)對(duì)微生物進(jìn)行誘變，并得到了較理想的結(jié)果.在2007年，魏麗勤等[2]通過(guò)返回式衛(wèi)星空間誘變的方法，對(duì)泰樂(lè)菌素的最終產(chǎn)量進(jìn)行了空間誘變，發(fā)現(xiàn)弗氏鏈霉菌產(chǎn)泰樂(lè)菌素比出發(fā)菌株增加了74.6%[2].荊士華等[3]在2011年將生黑醋酸桿菌送入太空，利用空間搭載對(duì)該菌株進(jìn)行誘變，經(jīng)過(guò)篩選得到了一株高活性的生黑醋酸桿菌G454，該菌株在縮短發(fā)酵周期的同時(shí)，提高了7.68%山梨糖產(chǎn)率[3].在2014年李雄超等[4]將干酪乳桿菌G5搭載“神舟八號(hào)”飛船進(jìn)進(jìn)入太空，進(jìn)行航天誘變，誘變后的菌株經(jīng)過(guò)篩選，獲得了2株高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌，其菌株胞外多糖的產(chǎn)量分別較對(duì)照提高1.9倍和1.7倍[4].

早在1899年，法國(guó)學(xué)者Tissier從母乳喂養(yǎng)的嬰兒糞便中分離得到了雙歧桿菌(Bifidobacterium)，該菌株形態(tài)不一，無(wú)芽孢，呈現(xiàn)革蘭氏陽(yáng)性，是一種厭氧型桿菌[5].經(jīng)過(guò)多位學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，該菌株在人體消化系統(tǒng)中有益生作用，可以促進(jìn)人體發(fā)育，提高人體免疫力，減緩衰老，同時(shí)在抗腫瘤方面也充當(dāng)重要角色[6-11].目前，在人體健康方面，雙歧桿菌已成為重要指標(biāo)之一[12].雙歧桿菌屬于專性厭氧菌，具有獨(dú)特的果糖-6-磷酸鹽磷酸酮酶，嚴(yán)格厭氧[13]，在加工、包裝和貯藏過(guò)程中活力降低，在應(yīng)用及貯存過(guò)程中接觸氧氣會(huì)嚴(yán)重威脅其存活及益生功能的發(fā)揮.因此，如何提高雙歧桿菌的耐氧性是促進(jìn)其廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵問(wèn)題.

本研究選用的長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68來(lái)源于健康長(zhǎng)壽老人腸道，研究表明BBMN68具有調(diào)節(jié)免疫[14-15]、改善腸道消化功能、改善便秘、增強(qiáng)機(jī)體免疫及抗衰老的作用[16-20]，是優(yōu)良的益生菌.2016年10月，長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68搭載“神舟十一號(hào)”飛船經(jīng)過(guò)33 d太空誘變后返回.本研究以長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68為出發(fā)菌株，利用航天誘變技術(shù)對(duì)其進(jìn)行誘變處理，以期獲得高產(chǎn)酸的突變株，并對(duì)篩選到的突變株進(jìn)行生長(zhǎng)情況、形態(tài)及耐受性評(píng)價(jià)，為菌株應(yīng)用提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株及空間搭載 本試驗(yàn)采用的出發(fā)菌株為長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)BBMN68，此菌株是本實(shí)驗(yàn)室從廣西巴馬長(zhǎng)壽老人的糞便中分離篩選得到的，經(jīng)研究，該菌株具有良好的益生功能.現(xiàn)菌株保存在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室.本試驗(yàn)將長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68凍干粉置于無(wú)菌搭載小管中，搭載前4 ℃保存.“神舟十一號(hào)”返回式飛船2016年10月17日發(fā)射，2016年11月18日返回地面，飛行過(guò)程中樣品置于飛船返回艙，返回地面后取出樣品，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，牛肉膏10 g，酵母浸粉5 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸二銨2 g，無(wú)水乙酸鈉5 g，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.58 g，硫酸錳(MnSO4·H2O)0.2 g，吐溫-80 1 mL，蒸餾水1 L，調(diào)節(jié)pH至6.5.

MRSC液體培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基中每升添加半胱氨酸0.5 g.

MRSC固體液體培養(yǎng)基：培養(yǎng)基成分同液體培養(yǎng)基，每升添加瓊脂15 g。

MRSC耐膽鹽培養(yǎng)基：MRSC液體培養(yǎng)基中膽鹽含量根據(jù)試驗(yàn)要求添加.

保護(hù)劑：12%脫脂乳中加入30%甘油.

所有培養(yǎng)基均121 ℃滅菌15min.

1.1.3 主要儀器及設(shè)備 WFZ UV-2102PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海Unico 公司；DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；XSZ-4G顯微鏡：COIC公司；TGL-16B臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；LDZM立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；DK-98-II2KW潔凈工作臺(tái)：天津泰斯特儀器公司；DELTA320 pH計(jì)：METTLER-TOELDO公司；T100 PCR儀：美國(guó)伯樂(lè)公司.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株分離與鑒定 將MRSC液體培養(yǎng)基分裝于厭氧管中，每管10 mL，向其充入氮?dú)?，使管中形成無(wú)氧條件，經(jīng)121 ℃滅菌15 min后備用.將航天誘變后菌粉接種于所述的pH 6.5的MRSC液體培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)12 h 后，將菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋，稀釋液均勻涂布于固體平板，將平板倒置于裝有厭氧產(chǎn)氣袋的厭氧盒中，將其放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h，從固體平板上挑取單菌落30個(gè)接種液體試管培養(yǎng)12 h后，進(jìn)行革蘭氏染色和鏡檢，觀察菌體顏色、大小、分叉形狀等是否符合雙歧桿菌屬的基本形態(tài)特征.按參考文獻(xiàn)[21]的方法提取菌株基因組DNA，并進(jìn)行16S rDNA基因序列分析以確定菌株純度.

1.2.2 菌株保藏 經(jīng)過(guò)鑒定后，確定為長(zhǎng)雙歧桿菌的菌株，將其接種在新鮮的pH 6.5的MRSC液體培養(yǎng)基中，將其放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12 h左右，將培養(yǎng)后的菌液在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行轉(zhuǎn)移，將其轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中進(jìn)行離心10 min(4 200～4 500 r/min)，棄去上清液，加入保護(hù)劑2 mL，充分混勻，用移液槍吸取1 mL分裝于1.5 mL離心管中，于-20 ℃中保存[22].

1.2.3 耐氧菌株的篩選 將經(jīng)過(guò)鑒定的菌株與野生株BBMN68接種、活化2代后，按1%接種量分別接種于pH6.5的MRS和MRSC液體培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h后，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)分別測(cè)定不同培養(yǎng)條件下的菌懸液的光密度值D600nm，并計(jì)算有氧條件與無(wú)氧條件下D600nm的比值.進(jìn)行穩(wěn)定重復(fù)試驗(yàn)，傳10代后，與野生株耐氧能力進(jìn)行比較，得到耐氧能力顯著高于野生株且穩(wěn)定性較好的突變株[23].

1.2.4 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將突變株與原始菌株BBMN68接種、活化2代后，按1%接種量分別接種于pH6.5的MRSC厭氧培養(yǎng)基中，將其放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)24 h，在培養(yǎng)過(guò)程中，每隔2 h用紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌懸液的光密度值D600nm，繪制D600nm光密度值對(duì)培養(yǎng)時(shí)間的生長(zhǎng)曲線[24].

1.2.5 透射電鏡分析 將突變株與原始菌株BBM N68接種、活化后，分別等量接種于pH值為6.5的MRSC培養(yǎng)基中，在厭氧條件下37 ℃連續(xù)培養(yǎng)12 h后，進(jìn)行下面透射電鏡樣品處理：

1)取樣：取培養(yǎng)后的樣品離心(轉(zhuǎn)速3 000～4 000 r/min)，棄去上清液，收集菌體，并用pH(7.2～7.4)的0.1 mol/L PBS清洗菌體3遍；清洗時(shí)菌體溫柔懸浮.

2)固定：將上述得到的菌體用2.5%戊二醛固定3 h，并用PBS清洗2遍，每遍10 min，再用純水清洗2遍.

3) 電鏡觀察：將固定后的菌體進(jìn)行透射電鏡TecnaiG2F20S-TWIN(200KV) 觀察.

1.2.6 菌株耐酸能力的測(cè)定 參考Patel的方法[25].將活化好的菌株以2%的比例接種于pH值為6.5的MRSC培養(yǎng)基中，在厭氧條件下37 ℃連續(xù)培養(yǎng)15 h后，分別以2%的接種量接種于pH值為4.0、3.5和3.0的MRSC培養(yǎng)基中.37 ℃下分別培養(yǎng)0、2、4 h，對(duì)突變菌株與原始菌株進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，計(jì)算菌株致死率.每組試驗(yàn)至少有3個(gè)重復(fù).

1.2.7 菌株耐膽鹽能力的測(cè)定 參考Patel的試驗(yàn)方法[25].將待測(cè)菌株接種、活化后，按2%接種量分別接種于pH6.5的MRSC培養(yǎng)基中，在厭氧條件下37 ℃連續(xù)培養(yǎng)15 h后，分別以2%的接種量接種于含0.1%、0.2%、0.3%膽鹽的MRSC膽鹽培養(yǎng)基中.37 ℃下分別培養(yǎng)0、1、2、3、4 h，對(duì)突變菌株與原始菌株進(jìn)行平板計(jì)數(shù).

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用Excel 2016和SPSS 19.0處理數(shù)據(jù)，運(yùn)用ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，平均值和標(biāo)準(zhǔn)差均由3個(gè)重復(fù)值所得.單因素方差檢驗(yàn)采用Duncan’s新復(fù)極差法檢測(cè)，顯著水平α=0.05.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離與鑒定結(jié)果

根據(jù)1.2.1所描述的方法進(jìn)行了菌株的分離與鑒定.經(jīng)電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，所挑取菌種的菌體形狀多數(shù)呈現(xiàn)棍棒狀，分叉 Y形棒狀.將這些菌株進(jìn)行DNA提取，并進(jìn)行16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物純化后委托上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序，得到了16個(gè)菌株，將測(cè)序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站上應(yīng)用BLAST 軟件在基因庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì).結(jié)果顯示，16株的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核心序列與長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68的基因序列一致，因此鑒定為長(zhǎng)雙歧桿菌.

2.2 耐氧菌株的篩選

由表1有氧無(wú)氧的光密度比值可知，16株菌株中，8株耐氧能力較野生株顯著下降，6株耐氧能力與野生株無(wú)差異，只有2株耐氧能力比野生株略高，即比值最高的2個(gè)菌株，分別為B-3-3和B-4-3.進(jìn)行穩(wěn)定性重復(fù)試驗(yàn)，傳10代后，與野生株耐氧能力進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表2.由表2可以看出，經(jīng)過(guò)10代后，有氧D600nm/厭氧D600nm比值只有B-4-3耐氧能力顯著高于野生株，說(shuō)明經(jīng)過(guò)航天誘變的菌株耐氧能力比野生株有一定的提高且具有一定的遺傳穩(wěn)定性.

表1 長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68在有氧與無(wú)氧條件下的生長(zhǎng)情況

同列相同字母表示不同菌株間無(wú)顯著性差異，同列不同字母表示不同菌株間有顯著性差異(P<0.05).

The same letters in the same column indicate no significant difference,the different letters indicate significant difference(P<0.05).

表2 突變株與野生株BBMN68耐氧能力比較

每列相同字母表示不同菌株間無(wú)顯著性差異；每列不同字母表示不同菌株間有顯著性差異(P<0.05).

The same letters in the same column indicate no significant difference,the different letters indicate significant difference(P<0.05).

2.3 耐氧菌株的生長(zhǎng)曲線

為了解突變株的生長(zhǎng)情況，測(cè)定了在600 nm處突變株與野生株2 4h的D值，結(jié)果見(jiàn)圖1.0～12 hD值不斷提高，16 h時(shí)達(dá)到對(duì)數(shù)穩(wěn)定期，此后曲線趨于平緩，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析B-4-3突變株在厭氧條件下的生長(zhǎng)情況基本與野生株保持一致，表明了其在耐氧性提高的同時(shí)，其原有生長(zhǎng)特性也沒(méi)有改變.

圖1 野生株BBMN68與突變株B-4-3 24 h生長(zhǎng)曲線Figure 1 Growth curve of wild-type strain BBMN68 and mutant strain B-4-3 for 24 h

2.4 耐氧菌株電鏡結(jié)果

野生株和突變株的形態(tài)比較見(jiàn)圖2.圖2-A為野生株，其形態(tài)呈彎曲棒狀，邊緣較整齊；圖2-B為突變株，其形態(tài)與野生株無(wú)差異，說(shuō)明航天誘變并沒(méi)有改變菌株形態(tài).

2.5 耐氧菌株耐酸能力評(píng)價(jià)

根據(jù)1.2.6的方法對(duì)野生株和突變株的耐酸能力進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表3.在不同 pH值的培養(yǎng)液中，雙歧桿菌活菌數(shù)隨 pH值的降低數(shù)量減少，雙歧桿菌在低 pH值條件下生長(zhǎng)受到抑制，其原因可能在于酸性環(huán)境使糖代謝關(guān)鍵酶(6-磷酸果糖激酶)受到了反饋抑制，使雙歧桿菌的代謝受到了抑制，減少了細(xì)胞構(gòu)建所需能量和物質(zhì)提供，從而阻遏了菌體生長(zhǎng)以及存活[26].此外，在pH值4.0培養(yǎng)2 h與4 h，突變株較野生株的存活率顯著升高，而在pH 3.5與pH 3.0條件下，突變株與野生株各時(shí)間存活率并無(wú)明顯差異，且存活率較低，說(shuō)明突變株維持了良好的耐酸能力.

圖2 長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68野生株(A)與突變株(B)形態(tài)Figure 2 Bifidobacterium longum BBMN68 wild strain (A) and mutant strain (B)

表3 耐氧菌株耐酸能力評(píng)價(jià)

同列相同字母表示不同菌株間無(wú)顯著性差異；同列不同字母表示不同菌株間有顯著性差異(P<0.05).

The same letters in the same column indicate no significant difference,the different letters indicate significant difference(P<0.05).

2.6 耐氧菌株耐膽鹽能力評(píng)價(jià)

野生株和突變株的耐膽鹽能力比較結(jié)果見(jiàn)表4.在不同膽鹽濃度的培養(yǎng)液中，雙歧桿菌活菌數(shù)隨 膽鹽濃度值的升高數(shù)量減少，雙歧桿菌在高膽鹽濃度條件下生長(zhǎng)受到抑制.0.1%膽鹽條件下培養(yǎng)2 h，野生株的存活率為62%左右，而突變株的存活率達(dá)到71%左右，比野生株提高了10%，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到4 h后，突變株與野生株存活率基本相同，且存活率保持在50%左右；與0.1%膽鹽含量相比，在0.2%與0.3%膽鹽含量的培養(yǎng)條件下，突變株與野生株的存活率均明顯下降，說(shuō)明膽鹽對(duì)于長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68的生長(zhǎng)有抑制作用.在膽鹽環(huán)境培養(yǎng)4 h過(guò)程中，突變株與野生株的存活率無(wú)顯著性差異，說(shuō)明航天誘變沒(méi)有降低長(zhǎng)雙歧桿菌對(duì)膽鹽的耐受能力.

表4 耐氧菌株耐膽鹽能力評(píng)價(jià)

同列相同字母表示不同菌株間無(wú)顯著性差異，同列不同字母表示不同菌株間有顯著性差異(P<0.05).

The same letters in the same column indicate no significant difference,the different letters indicate significant difference(P<0.05).

3 討論

航天誘變技術(shù)具有很多優(yōu)點(diǎn)，可以進(jìn)行多方面誘變，并且誘變率較高.本次試驗(yàn)采用的菌株為長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68，將其進(jìn)行航天誘變后，菌株的耐氧能力發(fā)生了較大的變化.結(jié)果顯示，突變株B-4-3耐氧能力顯著高于野生株，耐氧能力提高20%左右.本次試驗(yàn)將篩選得到的突變菌株連續(xù)傳代10次，突變菌株B-4-3耐氧能力在傳代1～10次間無(wú)顯著性差異，具有穩(wěn)定的遺傳性.

乳酸菌在工業(yè)生產(chǎn)中以及作為益生菌在人體胃腸道系統(tǒng)中都不可避免的面臨著來(lái)自外界環(huán)境的多種環(huán)境脅迫，如在發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中隨著乳酸的積累導(dǎo)致的酸脅迫、制劑化過(guò)程中的冷凍脅迫、在人體胃腸道系統(tǒng)中所經(jīng)歷的胃酸和膽鹽脅迫等，這些脅迫嚴(yán)重影響了乳酸菌的生長(zhǎng)、代謝及生理功能，從而影響了益生功能的發(fā)揮.因此，如何提高乳酸菌對(duì)各種環(huán)境脅迫的抗性，成為了學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界共同關(guān)注的焦點(diǎn).本試驗(yàn)對(duì)菌株的耐酸能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，突變株與野生株各時(shí)間存活率并無(wú)明顯差異，且存活率較低，說(shuō)明突變株維持了良好的耐酸能力.

膽汁酸在肝臟合成，并與?；撬岷透拾彼峤Y(jié)合形成膽鹽，廣泛存在于哺乳動(dòng)物和其他脊椎動(dòng)物體內(nèi)[27].在人體中，膽鹽的主要生理功能是作為生物乳化劑，乳化食物中的脂肪，促進(jìn)脂肪的消化吸收.磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)是微生物細(xì)胞膜的骨架，膽鹽可以破壞脂質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)而造成微生物細(xì)胞泄露甚至細(xì)胞死亡[28]，因此膽鹽是人體對(duì)抗外來(lái)有害微生物的重要生理屏障.然而膽鹽的這一生理功能也為口服益生菌產(chǎn)品的有效性帶來(lái)了負(fù)面影響，耐受宿主消化道的膽鹽成為益生菌篩選的必要前提條件.在現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道中，已有大量關(guān)于乳酸菌對(duì)膽鹽耐受機(jī)理的研究.其中，菌體表面疏水性[29]、菌體抗氧化能力[30]、膽鹽水解酶活性、膽鹽環(huán)境中的細(xì)胞完整性[31]是相關(guān)研究關(guān)注的主要生理指標(biāo)，菌體膽鹽耐受能力的變化，引起了相關(guān)生理指標(biāo)的變化.本文中耐膽鹽試驗(yàn)旨在證明航天誘變沒(méi)有降低長(zhǎng)雙岐桿菌對(duì)膽鹽的耐受能力.

本研究是利用空間搭載對(duì)長(zhǎng)雙岐桿菌BBMN68進(jìn)行誘變，改變其菌株的耐氧能力.本研究的突出點(diǎn)正是利用了這種新型的誘變技術(shù)，但其中也有不足之處，航天誘變并不能確保其某一特性變化的同時(shí)，保持其他性質(zhì)不變.原因在于航天誘變是利用太空特殊的環(huán)境使菌株產(chǎn)生突變，主要是通過(guò)強(qiáng)輻射、微重力、高真空等太空綜合環(huán)境因素誘發(fā)變異.航天誘變對(duì)含有益生菌的新型發(fā)酵乳制品的研制，似乎是一種有趣的方法.

4 結(jié)論

通過(guò)航天誘變共分離出16株突變菌株，獲得1株耐氧性能較好的菌株，在MRS不充氮?dú)獾膮捬豕苤锌梢哉ＩL(zhǎng)且具有一定的穩(wěn)定性，與野生株耐氧能力相比，一株突變株耐氧能力顯著提高.經(jīng)16S rDNA測(cè)序，鑒定該菌株仍為長(zhǎng)雙歧桿菌BBMN68.雙歧桿菌活菌數(shù)隨 pH值的降低數(shù)量減少，在較高pH值條件下，突變株較野生株的存活率顯著升高，在較低pH值條件下，突變株與野生株各時(shí)間存活率并無(wú)明顯差異；突變桿菌活菌數(shù)隨膽鹽濃度值的升高數(shù)量減少.耐受性試驗(yàn)說(shuō)明突變株在增加了耐氧能力的同時(shí)，仍基本保持了菌株原有的其他方面性能.本研究結(jié)果為益生菌BBMN68的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).