鄭雙芝，李曉菡，吳丹丹，陳怡怡，盧甜甜，周紫芳，白雪蓮

（杭州師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036）

海綿是最原始的多細(xì)胞動(dòng)物，屬于海洋中營(yíng)固著生活的一類動(dòng)物。近年來，研究者從海綿體內(nèi)發(fā)現(xiàn)許多可為醫(yī)藥素材的抗菌、抗病毒、抗腫瘤物質(zhì)，因此海綿具有良好的研究?jī)r(jià)值[1-2]。與傳統(tǒng)的化學(xué)合成抗菌藥相比，生物抗菌藥具有安全性高、抗菌效果好等特點(diǎn)。海綿共生菌的代謝產(chǎn)物中含有大量的抑菌活性物質(zhì)，其中很多均未開發(fā)，具有很好的研究前景。試驗(yàn)通過對(duì)磯海綿共生真菌代謝產(chǎn)物的體外抑制金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、惡臭假單胞菌 （Pseudomonas putida）、白色念珠菌（Candida albicans）、 小麥紋枯病菌 （Rhizoctonia cerealis） 4株致病菌的研究，篩選出抑菌活性強(qiáng)的共生真菌，為磯海綿共生真菌的開發(fā)與利用奠定基礎(chǔ)[3]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

磯海綿共生真菌 （Y3， Y4， Y5， J5， J6， J7，G7，G2），杭州師范大學(xué)天然防腐劑研究實(shí)驗(yàn)室保存；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida)、白色念珠菌（Candida albicans） 、 小麥紋枯病菌 （ Rhizoctonia cerealis） ，中國(guó)微生物菌種保藏中心提供。

1.1.2 試劑

PDA培養(yǎng)基、PDB培養(yǎng)基、乙酸乙酯（分析純）、二甲基亞砜（DMSO，色譜純） 等，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 共生真菌代謝產(chǎn)物制備

將8株磯海綿共生真菌分別接種于500 mL PDB液體培養(yǎng)基中，于28℃，140 r/min條件下振蕩培養(yǎng)7 d，離心（8 000 r/min，10 min），取上清液用等體積的乙酸乙酯重復(fù)萃取3次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，用DMSO溶解，分別配制成100，10，1 mg/mL 3個(gè)質(zhì)量濃度，備用[4]。

1.2.2 抑菌活性試驗(yàn)

采用96孔板法，將病原菌分別接種于PDB培養(yǎng)基中，在28℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)12 h。用無菌PDB培養(yǎng)基將上述發(fā)酵液細(xì)胞總數(shù)稀釋至105個(gè)/mL，采用96孔板法進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。每孔分別加入90μL的病原菌，再加入10μL不同質(zhì)量濃度共生真菌代謝產(chǎn)物（100，10，1 mg/mL）。在28℃下培養(yǎng)12 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔OD值，計(jì)算抑制率R=[（OD值空白組-OD值樣品組） /OD值空白組]×100%。金黃色葡萄球菌、惡臭假單胞菌2種病原菌OD值測(cè)定波長(zhǎng)為495 nm，陽(yáng)性對(duì)照為青霉素；白色念珠菌和小麥紋枯病菌OD值測(cè)定波長(zhǎng)為630 nm，陽(yáng)性對(duì)照為兩性霉素，以DMSO為空白組。每組做3個(gè)平行[5]。

2 磯海綿共生真菌抑菌活性研究

磯海綿共生真菌代謝產(chǎn)物復(fù)雜，采用乙酸乙酯相進(jìn)行萃取后，對(duì)其抑菌活性進(jìn)行研究，革蘭氏陰性菌惡臭假單胞菌、革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌、酵母菌白色念珠菌和霉菌小麥紋枯病菌為測(cè)試菌株，研究發(fā)現(xiàn)其代謝產(chǎn)物不同，抑制致病菌種類亦不同，抑制效果具有顯著性差異。

磯海綿共生真菌代謝產(chǎn)物對(duì)惡臭假單胞菌的抑制率見表1。

惡臭假單胞菌為革蘭氏陰性菌，常從腐敗的魚中檢出，是食品中存在的一種條件致病菌。由表1可知，菌株Y3代謝產(chǎn)物對(duì)惡臭假單胞菌抑制作用較強(qiáng)，當(dāng)Y3質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)抑制率為51.81%（±0.01），超過了50%，當(dāng)Y3質(zhì)量濃度為100 mg/mL時(shí)，抑制率達(dá)63.09%（±0.03），與10 mg/mL青霉素對(duì)惡臭假單胞菌抑制作用相近。當(dāng)Y4代謝產(chǎn)物質(zhì)量濃度為100 mg/mL時(shí)，抑制率達(dá)54.72%±0.04%，抑制作用較強(qiáng)。結(jié)果表明，磯海綿共生菌Y3和Y4的代謝產(chǎn)物中含有很強(qiáng)的抑制惡臭假單胞菌活性的化合物，需進(jìn)一步分離和純化。

表1 磯海綿共生真菌代謝產(chǎn)物對(duì)惡臭假單胞菌的抑制率 /%

磯海綿共生真菌代謝產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制率見表2。

表2 磯海綿共生真菌代謝產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制率/%

金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽(yáng)性菌的代表。其致病力強(qiáng)弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素，中毒食品種類多，如奶、肉、蛋、魚及其制品[6]。此外，油煎蛋、涼粉等引起的中毒事件也有報(bào)道。由表2可知，菌株Y3，Y4，J5，G2代謝產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制活性，且抑制率與菌株Y3，G2代謝產(chǎn)物濃度呈正相關(guān)性。J6，J7，G7，Y5，抑制作用不強(qiáng)或無抑制作用。其中，菌株G2代謝產(chǎn)物（質(zhì)量濃度為100 mg/mL）對(duì)金黃色葡萄球菌抑制率最高為48.10%±0.03%，菌株Y3代謝產(chǎn)物（100 mg/mL）對(duì)金黃色葡萄球菌抑制率為45.475±0.82%。

磯海綿共生真菌代謝產(chǎn)物對(duì)白色念珠菌的抑制率見表3。

白色念珠菌又稱白假絲酵母菌，易污染食品，尤其是長(zhǎng)期室溫放置的剩菜、剩飯等。由表3可知，菌株J6，G7，Y5的代謝產(chǎn)物對(duì)白色念珠菌有顯著抑制效果，其中菌株G7和菌株Y5抑制率最高，分別為50.82%±0.03%和43.94%±0.52%，抑制作用接近1 mg/mL兩性霉素，且與代謝產(chǎn)物質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，其抑菌活性物質(zhì)有待進(jìn)一步研究。

表3 磯海綿共生真菌代謝產(chǎn)物對(duì)白色念珠菌的抑制率/%

磯海綿共生真菌代謝產(chǎn)物對(duì)小麥紋枯病菌的抑制率見表4。

表4 磯海綿共生真菌代謝產(chǎn)物對(duì)小麥紋枯病菌的抑制率 /%

小麥?zhǔn)芗y枯菌侵染后，在各生育階段出現(xiàn)爛芽、病苗枯死、花稈爛莖等癥狀，造成小麥大量減產(chǎn)，是導(dǎo)致我國(guó)麥區(qū)病害的重要真菌。由表4可知，8株磯海綿共生真菌對(duì)小麥紋枯病菌抑制作用均較弱，100 mg/mL Y4代謝產(chǎn)物對(duì)小麥紋枯病菌抑制率最高，僅為22.09%±0.61%，顯著高于1 mg/mL兩性霉素，但未表現(xiàn)出質(zhì)量濃度依賴性。

3 結(jié)論

磯海綿共生菌Y3和Y4的代謝產(chǎn)物對(duì)惡臭假單胞菌具有很強(qiáng)抑制作用，菌株Y3，Y4，J5，G2代謝產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制活性，且抑制率與菌株Y3，G2代謝產(chǎn)物質(zhì)量濃度呈正相關(guān)性。菌株J6，G7，Y5的代謝產(chǎn)物對(duì)白色念珠菌有顯著抑制效果，其中菌株G7和菌株Y5抑制率最高，分別為50.82%±0.03%和43.945±0.52%。8株磯海綿共生真菌對(duì)小麥紋枯病菌抑制作用均較弱。磯海綿共生菌代謝產(chǎn)物對(duì)不同致病菌抑制作用不同，其化學(xué)組成有待進(jìn)一步研究。