田 宇，彭瞰看，宋春華，于 萍，劉 楠，包雨卓，孟 婧，徐慶華，蒼 晶

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030)

植物在光照條件下，其綠色組織通過光合作用產(chǎn)生煙酰胺腺嘌呤核苷酸磷酸(NADPH)，并用于碳固定、脂肪酸合成和氮同化等過程。然而，當(dāng)植物在黑暗中生長時(shí)，光合或非光合組織通過氧化戊糖磷酸途徑(OPPP)生成NADPH[1-2]。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH-EC 1.1.1.49)是戊糖磷酸途徑的限速酶，能夠催化6-磷酸葡萄糖氧化生成6-磷酸葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯，同時(shí)生成NADPH[3]。NADPH通過與其他抗氧化酶的相互作用清除有害的活性氧，從而維持細(xì)胞的氧化還原平衡[4]。葉建仁和黃素紅發(fā)現(xiàn)松樹G6PDH活性高的針葉抗病性高于其他針葉[5]。Zhang等[6]發(fā)現(xiàn)馬鈴薯花葉病毒侵染煙草，會使煙草胞質(zhì)和質(zhì)體中G6PDH活性升高。當(dāng)植物遭受低溫[7]、干旱[8]、鹽[9]等非生物脅迫時(shí)，其組織的G6PDH活性也均增加。可見，G6PDH在植物抵御生物及非生物脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用。G6PDH分為細(xì)胞質(zhì)G6PDH(cy-G6PDH)和質(zhì)體G6PDH兩類，分別存在于胞質(zhì)和質(zhì)體中[10]，其中質(zhì)體G6PDH又有P1(P1-G6PDH)和P2(P2-G6PDH) 兩種亞型[11]，不同亞型的G6PDH活性有所差別[12-13]。胞質(zhì)亞型與質(zhì)體亞型對還原力敏感性不同[14-15]，質(zhì)體中P1-G6PDH又比P2-G6PDH對NADPH更敏感[16-17]。各亞型G6PDH是否發(fā)揮作用以及如何發(fā)揮作用，與其存在的位置及周圍環(huán)境有關(guān)。

小麥(Triticumaestivum)生長過程中會受到低溫、干旱、鹽堿、重金屬、病蟲害等各種生物及非生物脅迫，進(jìn)而影響產(chǎn)量[18]。東農(nóng)冬麥1號是東北農(nóng)業(yè)大學(xué)自主培育的能克服黑龍江地區(qū)高寒氣候條件的強(qiáng)耐寒小麥品種。從實(shí)驗(yàn)室前期東農(nóng)冬麥1號的MicroRNA庫-靶基因KEGG通路分析中可知，G6PDH在低溫脅迫下差異表達(dá)[19]，因此判斷G6PDH在冬小麥抗寒性方面發(fā)揮著重要作用。本研究從Ensemble plants數(shù)據(jù)庫中(http://plants.ensembl.org/index.html)獲得 G6PDH蛋白序列及其基因序列，運(yùn)用生物信息學(xué)手段對其基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，在此基礎(chǔ)上對小麥 G6PDH蛋白進(jìn)行分類及理化性質(zhì)分析，同時(shí)對低溫脅迫下強(qiáng)抗寒冬小麥品種東農(nóng)冬麥1號和弱抗寒冬小麥品種濟(jì)麥22的分蘗節(jié)及葉片中該酶基因不同亞型的表達(dá)模式進(jìn)行定量分析，以期為深入探究G6PDH在小麥抗寒性方面的功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)所用冬小麥為強(qiáng)抗寒性品種東農(nóng)冬麥1號和弱抗寒性品種濟(jì)麥22，于2016年9月13日播種于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田中，完全區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，行長2 m，行距0.2 m，10行區(qū)。播種量450?！-2，播深5 cm，常規(guī)田間管理。待大田自然降溫，連續(xù)10 d最低溫度平均為5 ℃(對照溫度，2016年10月8日)、0 ℃(2016年10月25日)、-10 ℃(2016年11月9日)和-25 ℃(2017年1月11日)時(shí)，隨機(jī)選取長勢一致的麥苗，剪取分蘗節(jié)和葉片，液氮速凍，-80 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 G6PDH序列的獲取與鑒定

從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得G6PDH典型結(jié)構(gòu)域序列，以其為標(biāo)準(zhǔn)序列，在Ensemble plants數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl.org/index.html)、水稻基因組數(shù)據(jù)庫(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)、TAIR (https://www.arabidopsis.org/)上進(jìn)行blast同源序列比對，分別獲得小麥(Triticumaestivum)、水稻(Oryzasativa)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)中顯著同源的 G6PDH蛋白序列。利用在線工具 SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)和Pfam (http://pfam.xfam.org/)對候選 G6PDH蛋白序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，去除不包含G6DPH結(jié)構(gòu)域的蛋白序列，再利用軟件DNAMAN 8.0分別對3個(gè)物種的 G6PDH蛋白序列進(jìn)行比對，去除冗余序列。隨后在基因組數(shù)據(jù)庫中獲取小麥 G6PDH蛋白相應(yīng)的基因序列。

1.2.2 生物信息學(xué)分析

利用ProtComp 9.0 (http://linux1.softberry.com/berry.phtml)對候選小麥 G6PDH蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。通過在線分析工具ExPASy-ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測 G6PDH蛋白的基本理化性質(zhì)。利用在線預(yù)測軟件NPS-SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測G6PDH的二級結(jié)構(gòu)，統(tǒng)計(jì)G6PDH二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和延伸鏈等結(jié)構(gòu)所占的百分比。用ExPASy-SWISS MODE (http://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測 G6PDH蛋白的三級結(jié)構(gòu)。利用MEGA 6.0軟件中的鄰接法算法(Neighbor-Joining)將獲得的小麥 G6PDH蛋白序列分別與水稻、擬南芥中的同源蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，設(shè)置參數(shù)為：Bootstrap進(jìn)行1 000次檢驗(yàn)并去除支持率低于50%的節(jié)點(diǎn)，選取P-distance模型，Pairwise Deletion處理數(shù)據(jù)缺失。通過Ensemble plants數(shù)據(jù)庫獲得TaG6PDH基因全序列及CDS序列，利用GSDS (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)對TaG6PDH基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。通過MEME (http://meme.nbcr.net/meme/)對 G6PDH蛋白進(jìn)行保守Motif分析，設(shè)置參數(shù)為：Motif長度20～50個(gè)字符，最多可檢測到15個(gè)，并且允許顯示重復(fù)位點(diǎn)。

1.2.3 總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成

利用Ultrapure RNA kit(康為世紀(jì)，北京)分別提取越冬期分蘗節(jié)與葉片的總RNA。通過PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，日本)進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.2.4TaG6PDH基因的qRT-PCR分析

從小麥G6PDH三種亞型中各選取一個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR分析。根據(jù)TaG6PDH4(胞質(zhì)亞型)、TaG6PDH5(P1亞型)、TaG6PDH11(P2亞型)基因序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量引物(表1)，以Actin作為內(nèi)參基因，在Mx-3000p Real-time PCR System(吉泰生物，上海)利用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(諾唯贊，南京)對基因進(jìn)行qRT-PCR分析，反應(yīng)體系及程序參照試劑說明書。每個(gè)基因的表達(dá)分析均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，基因相對表達(dá)水平采用2-△△CT法進(jìn)行 計(jì)算。數(shù)據(jù)顯著性分析利用SPSS軟件進(jìn)行 計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥、水稻、擬南芥G6PDH同源序列的獲取

從NCBI上獲取 G6PDH蛋白的保守結(jié)構(gòu)域PLN02539的氨基酸序列，隨后在小麥基因組數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行blastp同源比對，獲得26條蛋白同源序列，隨后通過在線工具SMART和Pfam去除不包含保守結(jié)構(gòu)域的序列，再通過DNAMAN 6.0比對去除冗余序列，最終確定12條候選序列，分別命名為TaG6PDH1～12(表2)。隨后用相同的方法在水稻數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blastp同源比對，篩選后獲得4條水稻 G6PDH蛋白序列，分別命名為OsG6PDH1～4 (Acc:Os02g38840、Os07g22350、Os03g29950、Os03g20300)。最后在擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(TAIR)中下載 G6PDH蛋白序列，共6條，分別命名為AtG6PDH1～6(Acc:AT5G35790、AT5G13110、AT1G24280、AT1G09420、AT3G27300、AT5G40760)。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

2.2 G6PDH蛋白的亞細(xì)胞定位及理化性質(zhì)分析

ProtComp 9.0分析表明，小麥 G6PDH蛋白只存在于細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)體兩個(gè)部位。這12條小麥 G6PDH蛋白，只有3條定位在細(xì)胞質(zhì)，其余9條皆定位在質(zhì)體中。利用ExPASy-ProtParam分析12條蛋白的理化性質(zhì)(表2)，可以看出所有序列都含有20種氨基酸，序列長度在448～920 aa之間，最短的為TaG6PDH10和TaG6PDH11，最長的為TaG6PDH7。相對分子質(zhì)量最大的是TaG6PDH7(103.22 kDa)，最小的是TaG6PDH3 (50.95 kDa)。理論等電點(diǎn)最低的是TaG6PDH6(4.98)，最高的是TaG6PDH9 (8.77)，其中等電點(diǎn)>7的有5條，<7的有7條。氨基酸不穩(wěn)定指數(shù)均大于40，均為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。平均親水性系數(shù)均為負(fù)值，可見這12條蛋白質(zhì)均為親水蛋 白質(zhì)。

表2 G6PDH的理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical parameters of G6PDH

MW:分子量; pI:等電點(diǎn)。

MW:Molecular weight; pI:Isoelectric point.

2.3 TaG6PDH蛋白的二級及高級結(jié)構(gòu)預(yù)測

蛋白二級結(jié)構(gòu)是連接一級和高級結(jié)構(gòu)的重要紐帶和橋梁。利用SOPMA對小麥TaG6PDH蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TaG6PDH蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、延伸鏈、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲4種成分組成(表3)。其中α-螺旋、無規(guī)則卷曲為主要成分，延伸鏈、β轉(zhuǎn)角相對較少。α-螺旋含量最高的是 TaG6PDH3，最低的是TaG6PDH9，無規(guī)則卷曲含量最高的是TaG6PDH12，最低的是 TaG6PDH7。以TaG6PDH1為例繪制二級結(jié)構(gòu)圖，表明α-螺旋、無規(guī)則卷曲是構(gòu)成 G6PDH蛋白的主要元件。

隨后利用SWISS-MODEL對TaG6PDH蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)相一致，α-螺旋、無規(guī)則卷曲依舊是主要的結(jié)構(gòu)元件，占據(jù)了很大一部分空間(圖略)。

表3 TaG6PDH蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Table 3 Predicted secondary structure of TaG6PDH proteins

2.4 G6PDH蛋白的進(jìn)化分析

將小麥、水稻、擬南芥 G6PDH蛋白進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建來分析它們之間的進(jìn)化關(guān)系(圖1)。結(jié)果，G6PDH蛋白被分為4組，每組中都存在TaG6PDH、AtG6PDH、OsG6PDH。此外，還發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)發(fā)生樹中有4對姐妹組合，分別是TaG6PDH3-TaG6PDH5、TaG6PDH11-TaG6PDH12、TaG6PDH6-TaG6PDH8、TaG6PDH1-TaG6PDH4。

2.5 小麥 TaG6PDH基因結(jié)構(gòu)分析

12條小麥TaG6PDH基因大體可以分為4組(圖2)，其中TaG6PDH2、 TaG6PDH3、TaG6PDH5為第1組，它們的基因結(jié)構(gòu)都是由4個(gè)外顯子與3個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。TaG6PDH10、TaG6DPH11、TaG6PDH12為第2組，其中TaG6PDH10、TaG6PDH11都由5個(gè)外顯子與4個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，只有TaG6PDH12是由4個(gè)外顯子與3個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。TaG6PDH6、 TaG6PDH7、TaG6PDH8為第3組，都是由6個(gè)外顯子與5個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。第4組由TaG6PDH1、TaG6PDH4、TaG6PDH9組成，這3條基因的結(jié)構(gòu)沒有明顯規(guī)律，這可能與其在植物體內(nèi)行使主要功能有關(guān)。

圖1 G6PDH蛋白的進(jìn)化樹

圖2 小麥 G6PDH基因的結(jié)構(gòu)

2.6 TaG6PDH蛋白的保守Motif分析

通過在線分析軟件MEME (http://meme.nbcr.net/meme/)對 G6PDH蛋白進(jìn)行保守Motif分析(圖3)，結(jié)果可見，這15個(gè)Motif的長度范圍在20～50之間，通過Pfam上預(yù)測，可以發(fā)現(xiàn)Motif1～10中都存在G6PD_C結(jié)構(gòu)域，Motif1、2、3、4、5、6、7、8、10均存在于12條 G6PDH蛋白中。與這9個(gè)Motif相比，Motif11只存在于 TaG6PDH3、TaG6PDH6、TaG6PDH11中；Motif12只存在于 TaG6PDH7、TaG6PDH8中；Motif13只存在于TaG6PDH2、TaG6PDH5中；Motif14只存在于TaG6PDH8中；Motif15只存在于TaG6PDH1、TaG6PDH4中。而Motif 9既不普遍存在于12條G6PDH蛋白中,也不個(gè)別存在于某幾個(gè)蛋白中。此外Motif3中存在底物結(jié)合位點(diǎn)(RIDHYLGKEL)，Motif4中存在NADP+結(jié)合位點(diǎn)(NEFVIRVQP)[11]，這2個(gè)Motif都保守存在于12條TaG6PDH蛋白中。

圖3 小麥 G6PDH蛋白的保守Motif

2.7 低溫脅迫下 TaG6PDH的表達(dá)特征分析

分別從小麥G6PDH不同亞型中選取了3個(gè)基因(TaG6PDH4、TaG6PDH5、TaG6PDH11)進(jìn)行低溫脅迫下的表達(dá)模式分析。表4中東農(nóng)冬麥1號和濟(jì)麥22分蘗節(jié)及葉片中基因表達(dá)量均以 5 ℃為對照。胞質(zhì)亞型TaG6PDH4在兩個(gè)冬小麥品種的分蘗節(jié)和葉片中的表達(dá)量均隨著溫度的降低而逐漸升高，并且都在-10 ℃時(shí)快速升高，-25 ℃達(dá)到最大值。P1亞型TaG6PDH5在兩個(gè)冬小麥品種的分蘗節(jié)中，隨著溫度的降低，表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在-10 ℃時(shí)達(dá)到最高；而在葉片中，基因表達(dá)量的變化則是呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，同樣在-10 ℃開始快速升高， -25 ℃達(dá)到最大值；從表達(dá)量變化倍數(shù)上可以看出，TaG6PDH5葉片中的表達(dá)量要高于分蘗節(jié)。P2亞型TaG6PDH11在兩個(gè)冬小麥品種分蘗節(jié)和葉片中的表達(dá)量變化隨著溫度的降低雖然也呈現(xiàn)上升的趨勢，但變化倍數(shù)明顯低于前兩個(gè)基因(表4)。從3個(gè)基因的表達(dá)模式中可以看出，TaG6PDH的不同亞型隨著溫度的變化以及組織部位的不同，基因表達(dá)模式也有所區(qū)別。

3 討 論

本研究表明，小麥 G6PDH蛋白只存在于細(xì)胞質(zhì)與質(zhì)體中，這與前人的報(bào)道結(jié)果一致[20]；所分析的12條小麥 G6PDH蛋白中，有3條定位在細(xì)胞質(zhì)，9條定位在質(zhì)體，即質(zhì)體中的同工酶數(shù)量大于細(xì)胞質(zhì)中同工酶的數(shù)量，這與其他植物中 G6PDH蛋白的分布規(guī)律相一致[21]。

系統(tǒng)發(fā)生樹中擬南芥、小麥和水稻的G6PDH具有很近的親緣關(guān)系，證明G6PDH在進(jìn)化上高度保守[22]。從先前報(bào)道中可知，擬南芥AtG6PDH5、 AtG6PDH6屬于胞質(zhì)亞型； AtG6PDH1屬于質(zhì)體P1亞型；AtG6PDH2、 AtG6PDH3屬于質(zhì)體P2亞型； AtG6PDH4比較特殊，定位在質(zhì)體中，但并不屬于P1、P2任何一種亞型[23]。因此，從進(jìn)化關(guān)系上可以推斷小麥的TaG6PDH1、TaG6PDH4、TaG6PDH9屬于胞質(zhì)亞型；TaG6PDH2、 TaG6PDH3、TaG6PDH5屬于P1亞型；TaG6PDH10、TaG6PDH11、TaG6PDH12屬于P2亞型。小麥的TaG6PDH6、 TaG6PDH7、TaG6PDH8與擬南芥的 AtG6PDH4親緣關(guān)系較近，推斷這3條蛋白定位于質(zhì)體，但并不屬于已知的任何一種亞型，具體功能有待后續(xù)研究。小麥不同亞型的TaG6PDH基因結(jié)構(gòu)也有所差別，主要表現(xiàn)在外顯子與內(nèi)含子數(shù)量上的變化，這可能是由結(jié)構(gòu)性的分化機(jī)制所導(dǎo)致的，例如，外顯子和內(nèi)含子的插入或缺失以及外顯子化和偽外顯子化[24]。12條小麥TaG6PDH蛋白Motif排列大體相近，Motif3中存在的底物結(jié)合位點(diǎn)(RIDHYLGKEL)與Motif4中存在的NADP+結(jié)合位點(diǎn)(NEFVIRVQP)，保證了TaG6PDH蛋白的基礎(chǔ)功能。

表4 低溫脅迫下 TaG6PDH基因的表達(dá)模式Table 4 Expression patterns of TaG6PDH under cold stress

同一基因、同一列數(shù)據(jù)后的大、小寫字母不同分別表示不同溫度處理之間的差異達(dá)到了0.05和0.01顯著性水平。

The upper and lower case letters within the same gene and the same column following the data indicate significant differences between different temperature treatments at 0.05 and 0.01 levels.

低溫脅迫下兩個(gè)冬小麥品種分蘗節(jié)中胞質(zhì)亞型TaG6PDH4的基因表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，并且基因表達(dá)量變化倍數(shù)要遠(yuǎn)高于其他兩種亞型的TaG6PDH基因，表明胞質(zhì)亞型TaG6PDH4在冬小麥響應(yīng)低溫脅迫時(shí)發(fā)揮了主要作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，P1亞型在葉片等綠色組織中表達(dá)較高[25]。本實(shí)驗(yàn)中，低溫脅迫下P1亞型TaG6PDH5基因在分蘗節(jié)中雖也有較高表達(dá)，但與其在葉片中的基因表達(dá)量變化相比依舊有很大差距，因此可以推斷，低溫脅迫下P1亞型 TaG6PDH主要是在葉片等綠色組織中發(fā)揮作用；而P2亞型TaG6PDH11基因表達(dá)量在分蘗節(jié)及葉片中都沒有較大的變化，但整體趨勢依舊是隨著溫度的降低而升高，可見，不同亞型的TaG6PDH對溫度脅迫反應(yīng)不同，但總體表現(xiàn)為 TaG6PDH在小麥抗寒方面發(fā)揮正向積極作用。東農(nóng)冬麥1號是強(qiáng)抗寒冬小麥品種，而濟(jì)麥22號則是弱抗寒品種，無論是在分蘗節(jié)還是葉片中，3種亞型的TaG6PDH基因在東農(nóng)冬麥1號中的表達(dá)量變化倍數(shù)都要遠(yuǎn)高于濟(jì)麥22，因此，可以認(rèn)為TaG6PDH表達(dá)量變化可以作為判斷小麥抗寒強(qiáng)弱的一種指標(biāo)。