付國勇，張永永，劉新春，李東梅，蔡 羽，時麗潔，王丹丹，馮宗云

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院大麥青稞研究中心，四川成都 611130)

青稞(HordeumvulgareL. var.nudumHook.f.)是禾本科小麥族大麥屬的一年或多年生草本植物[1]。青稞作為海拔4 200 m以上農(nóng)田的唯一種植作物，其高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)對于穩(wěn)定和促進(jìn)藏區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要意義。但由于在生長發(fā)育中易遭受高溫、低溫和鹽等非生物脅迫，嚴(yán)重影響了青稞的品質(zhì)和產(chǎn)量。目前，對于高溫、低溫和鹽脅迫的研究主要集中在小麥和水稻灌漿過程中環(huán)境對籽粒淀粉形成的影響[2-4]，而對作物在幼苗期的非生物脅迫則主要集中在作物葉片生理生化方面[5-7]，對葉片中參與了逆境抗性的淀粉基因及其表達(dá)情況則鮮有報道。

淀粉不僅是人類攝取能量的主要來源，也是重要的工業(yè)原材料[8]。淀粉又分為直鏈淀粉(amylose)和支鏈淀粉(amylopectin)。直鏈淀粉分支較少，是以α-1,4-糖苷鍵連接而成的高分子聚合體。支鏈淀粉分支較多，是以α-1,4-糖苷鍵為主鏈，在α-1,6-糖苷鍵部位形成葡聚糖分支后形成的高分子聚合體。淀粉分支酶(starchbranching enzymes,SBEs)主要參與了支鏈淀粉的合成，研究發(fā)現(xiàn)，有SBEⅠ和SBEⅡ兩種分支酶，在單子葉植物中SBEⅡ基因存在SBEⅡa和SBEⅡb兩種形式，其中SBEⅡb特異性地在胚乳中進(jìn)行表達(dá)，而SBEⅡa在各個組織中都有表達(dá)[9]。任 欣等[10]對5個青稞品種的淀粉理化性質(zhì)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)5種青稞淀粉顆粒大部分呈圓形，小部分呈橢圓形，青稞淀粉顆粒的體積平均粒徑和表面積平均粒徑之間均存在顯著性差異。鄭許光等[11]的研究表明，青稞籽粒灌漿期總淀粉、直鏈淀粉和支鏈淀粉的合成速率均呈單峰曲線變化，即先增加后降低，且在花后21 d左右達(dá)到最大積累速率。鄒弈星等[12]通過對122份來自西藏的青稞品種(系)的淀粉特性的分析，發(fā)現(xiàn)供試材料的淀粉特性差異較大，直鏈淀粉含量和峰值黏度間存在極顯著的相關(guān)性。Tang等[13]對青稞籽粒發(fā)育過程中淀粉的合成進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在籽粒發(fā)育過程中SuSy、AGPase和SBEⅡa有明顯的上調(diào)表達(dá)。Chen等[14]對西藏青稞籽粒發(fā)育時期的籽粒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)青稞籽粒中SBEⅠ在花后15 d表達(dá)量顯著增加，但在其他組織中表達(dá)量普遍較低；SBEⅡa在所有組織中的表達(dá)較為穩(wěn)定，只是在花后15 d表達(dá)量達(dá)到最大；SBEⅡa的只在發(fā)育的籽粒中檢測到轉(zhuǎn)錄，其表達(dá)量在花后15 d時達(dá)到最大。

鑒于前人對SBE的研究主要集中在SBEⅡb上，但對廣泛分布于植物組織中的SBEⅡa卻鮮有報道。本研究以楊智敏等[15]測定的胚乳中高支鏈淀粉品種喜馬拉雅2號和低支鏈淀粉品種康青1號為材料，分析三葉一心期葉片中SBEⅡa基因的序列特征，以及在高溫、低溫和鹽脅迫條件下葉片中該基因的表達(dá)特征及酶活性，以期了解SBEⅡa基因在不同環(huán)境中的變化情況，為后期培育低淀粉青稞品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料的培養(yǎng)與脅迫處理

供試材料為青稞品種喜馬拉雅2號和康青1號，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院大麥青稞研究中心保存。挑選大小均勻一致的喜馬拉雅2號和康青1號種子，分別種植于直徑20 cm的花盆中，一次性澆足水分。然后將花盆轉(zhuǎn)移至PGX型多段可編程光照培養(yǎng)箱(寧波東南，浙江寧波)，培養(yǎng)條件控制在25 ℃，光照強(qiáng)度為6 000 lx，光周期為16 h光照、8 h黑暗。待幼苗長至三葉一心時，分別進(jìn)行高溫、低溫和鹽脅迫處理，其中高溫在37 ℃條件下進(jìn)行；低溫在4 ℃條件下進(jìn)行；鹽脅迫時用蒸餾水將青稞根部泥土和雜質(zhì)清洗干凈，將水分吸干后置于300 mmol·L-1的NaCl溶液中進(jìn)行處理。在處理后的第2、4、6、8、10、12、24和48 h分別采集葉片，經(jīng)液氮速凍后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 青稞 SBEⅡa基因的克隆

參照大麥SBEⅡa(GenBank登錄號為FN179383.1)序列，利用 Primer premier 5.0 軟件設(shè)計引物，引物序列均由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。設(shè)計三段特異性引物(表1)進(jìn)行青稞SBEⅡa基因的克隆。

根據(jù)RNAplant Plus植物總RNA提取試劑盒(天根，北京)提取青稞葉片的總RNA，隨后參照TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒(天根，北京)說明書以青稞葉片總RNA為模板合成cDNA第一鏈，最后以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，以SBEⅡa-1F/1R、SBEⅡa-2F/2R和SBEⅡa-3F/3R分別為目的基因的引物(表1)，擴(kuò)增目的基因。擴(kuò)增體系與程序參考Taq酶說明書(TaKaRa，日本)，其中循環(huán)數(shù)為35，退火溫度分別為58 ℃、60 ℃和58 ℃，延伸時間為30 s。利用1%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測PCR產(chǎn)物，并參照普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根，北京)說明書回收產(chǎn)物。將回收的產(chǎn)物連接至pMD19-T Simple Vector(TaKaRa，日本)，反應(yīng)條件參考說明書。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α 菌株，以表1中的分段引物參考擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR，分別挑選5個獨立的陽性克隆，送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

表1 引物名稱及用途Table 1 The primer pairs and their application

1.3 SBEⅡa基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

利用DNAstar軟件分析SBEⅡa基因序列；利用ExPASy-ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)分析SBEⅡa編碼蛋白的理化性質(zhì)；利用CBS-SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對該蛋白的信號肽進(jìn)行預(yù)測；利用CBS-TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對該蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；使用Cell-PLoc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)中的Plant-mPloc預(yù)測SBEⅡa蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位。利用DNAMAN8軟件和在線軟件SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析該蛋白在不同物種中的保守結(jié)構(gòu)域；利用MEGA6.06軟件構(gòu)建該蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 SBEⅡa基因?qū)崟r熒光定量PCR分析

以青稞組成型基因β-actin為內(nèi)參基因，設(shè)計引物對Q-β-actin-F/R；根據(jù)克隆的青稞SBEⅡa基因序列，設(shè)計引物對Q-SBEⅡa-F/R(表1)。按照TB GreenTMPremix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa，日本)說明書于CFX96-C1000型熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國)上進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)條件參考說明書。相對定量分析的計算方法參照2-△△CT法[16]。上述試驗在每次獨立試驗中每個樣品設(shè)3次重復(fù)，而且這樣的獨立實驗至少重復(fù)3次。

1.5 SBEⅡa蛋白酶活性的測定

青稞葉片SBEⅡa蛋白酶活性的測定參照淀粉分支酶(SBE)測試盒(EC 2.4.1.18)(蘇州科銘，江蘇蘇州)的操作步驟進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞 SBEⅡa基因克隆的結(jié)果分析

分別提取喜馬拉雅2號和康青1號三葉一心期葉片中的總RNA，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA的完整性。隨后，分別以兩個材料的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用三對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到與預(yù)期片段相符的條帶(圖1)。將獲得的目的條帶切膠回收連接至pMD19-T Simple Vector，轉(zhuǎn)入E.coliDH5α獲得陽性克隆后測序，將測得的序列進(jìn)行拼接，經(jīng)BlastN比對后發(fā)現(xiàn)兩個青稞品種SBEⅡa基因的編碼區(qū)與大麥SBEⅡa基因編碼區(qū)(FN179383.1)相似度為99%，表明獲得了青稞SBEⅡa基因ORF區(qū) 序列。

2.2 青稞 SBEⅡa基因編碼蛋白的生物信息學(xué) 分析

2.2.1 基本理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)、信號肽和亞細(xì)胞定位預(yù)測分析

通過DNAstar軟件分析青稞SBEⅡa基因序列，結(jié)果表明SBEⅡa基因ORF區(qū)全長2 466 bp，共編碼821個氨基酸。通過ExPASy-ProtParam分析青稞SBEⅡa蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果表明其分子式為C4157H6266N1126O1234S30，分子量92.7 kDa，等電點pI為5.40。該蛋白負(fù)電荷的氨基酸(Asp+Glu)有117個，正電荷氨基酸(Arg+Lys)有85個，含甘氨酸(Gly)數(shù)量最多，為74個，占該蛋白所有氨基酸組成的9.0%；而半胱氨酸(Cys)數(shù)量最少，只有5個，占比為0.8%。不穩(wěn)定系數(shù)為38.03，屬于穩(wěn)定蛋白。

A：康青1號電泳圖；B：喜馬拉雅2號電泳圖；1：SBEⅡa基因的第一段，大小為853 bp；2：SBEⅡa基因的第二段，大小為919 bp；3：SBEⅡa基因的第三段，大小為1 073 bp；4：SBEⅡa基因的第三段，大小為1 072 bp。M：DL 2000 DNA分子標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量。

A:Image of gene separation from Kangqing 1;B:Image of gene separation from Himalaya 2;1:The first segment ofSBEⅡagene(853 bp); 2:The second segment ofSBEⅡagene(919 bp);3:The third segment ofSBEⅡagene(1 073 bp);4:The third segment ofSBEⅡagene(1 072 bp).M:Molecular marker DL 2000.

圖1SBEⅡa基因分段克隆

Fig.1 Segmented cloning ofSBEⅡagene

利用 CBS-SignalP 4.1人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法進(jìn)行信號肽預(yù)測，根據(jù)前70個氨基酸的C-score (raw cleavage site score)、S-score (signal peptide score)、Y-score (combined cleavage site score)均為沒有大的起伏且都沒有超過閾值0.5，可知該蛋白N端極有可能沒有任何信號肽，不屬于胞外分泌性蛋白。利用TMHMM 2.0進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果表明該蛋白不具有跨膜結(jié)構(gòu)；利用Cell-PLoc 2.0中Plant-mPloc進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，結(jié)果表明該蛋白定位于葉綠體上。

2.2.2 青稞SBEⅡa編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域 分析

根據(jù)DNAMAN8軟件進(jìn)行序列比對，SMART軟件進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測，結(jié)果(圖2)表明，青稞的SBEⅡa蛋白保守域區(qū)間為331～686，與α-淀粉酶結(jié)構(gòu)域具有一致性。

2.2.3 SBEⅡa編碼蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

采用MEGA6.06軟件對SBEⅡa蛋白與其他19種不同物種蛋白質(zhì)的親緣關(guān)系構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，結(jié)果表明，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育可分為兩大類，細(xì)江蘺(AAB97471.1)單獨歸為一類，其余19種植物歸為一類；19種植物又可以劃分為兩大類，其中與青稞SBEⅡa蛋白親緣關(guān)系最近的是大麥(CAX51366.1)，其次是粗山羊草(AAK26821.1)，與玉米(AAA18571.1)的親緣關(guān)系也較近，而與細(xì)江蘺(AAB97471.1)的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.3 不同逆境條件下 SBEⅡa基因的表達(dá)分析

高溫處理后(圖4)，喜馬拉雅2號和康青1號葉片中SBEⅡa基因都有一個顯著的變化過程，都在處理10 h 時葉片中SBEⅡa基因的表達(dá)量都達(dá)到最大，喜馬拉雅2號在24 h 時葉片中SBEⅡa基因的表達(dá)量為最小，康青1號在48 h 時葉片中SBEⅡa基因的表達(dá)量為最小。在處理的前10 h 內(nèi)，喜馬拉雅2號葉片中SBEⅡa基因的表達(dá)量都高于康青1號，可能是在一定時間的高溫環(huán)境下喜馬拉雅2號葉片中SBEⅡa基因的表達(dá)對高溫的敏感性和適應(yīng)性要遠(yuǎn)高于康青1號；同時喜馬拉雅2號葉片中SBEⅡa基因的表達(dá)量在10 h 之前隨著處理時間的增加基本保持一致，彼此之間的差異較小，而康青1號葉片中SBEⅡa基因的表達(dá)則隨著處理時間的增加呈現(xiàn)一個逐漸增加的過程，直至達(dá)到基因表達(dá)量的最大值，這說明SBEⅡa基因的表達(dá)存在個體差異性。

低溫處理后(圖4)，喜馬拉雅2號和康青1號的葉片中SBEⅡa基因都在處理10 h 時表達(dá)量達(dá)到最大，但喜馬拉雅2號和康青1號葉片中SBEⅡa基因表達(dá)量的最小值分別出現(xiàn)在處理2 h和48 h時。整體來看，在低溫處理過程中，喜馬拉雅2號葉片中SBEⅡa基因表達(dá)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于康青1號，這可能和不同材料對低溫的敏感性和適應(yīng)性差異有關(guān)。兩者在整個處理過程中基因的表達(dá)量都存在明顯的變化，但是二者葉片中基因的表達(dá)量變化卻不存在顯著性差異。在處理的2、12、24和48 h二者之間的基因表達(dá)量變化不大，基因表達(dá)量差異較為明顯的處理時間為4 、6 、8 和 10 h，這說明參試材料葉片中SBEⅡa基因?qū)Φ蜏氐拿舾行暂^強(qiáng)，可能與青稞自身適應(yīng)高海拔環(huán)境有關(guān)。

鹽脅迫處理后(圖4)，喜馬拉雅2號和康青1號的葉片中SBEⅡa基因在不同時間段的表達(dá)量存在差異，其中喜馬拉雅2號葉片中SBEⅡa基因的表達(dá)對鹽脅迫較敏感，在處理4 h 時表達(dá)量達(dá)到最大值，隨后隨著處理時間的延長，基因表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，但康青1號葉片中SBEⅡa基因的表達(dá)對鹽脅迫的耐受性較高，在處理8 h時基因表達(dá)量才達(dá)到峰值，且在 10 h時的基因表達(dá)量和8 h時的表達(dá)量差異不大，這一結(jié)果說明在耐鹽性方面康青1號葉片 中SBEⅡa基因的表達(dá)耐受性要強(qiáng)于喜馬拉雅 2號。

方框內(nèi)所示為該蛋白的保守域。 The sequence in red boxes is conserved domain of SBEⅡa protein.

圖3 SBEⅡa蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 不同處理下兩個青稞品種 SBEⅡa基因的定量表達(dá)分析

2.4 不同逆境下SBEⅡa蛋白酶活性的測定結(jié)果

高溫處理后(圖5)，喜馬拉雅2號葉片中SBEⅡa蛋白酶活性普遍高于康青1號，但二者的SBEⅡa蛋白酶活性在高溫處理10 h 時均達(dá)到最大，48 h 時均最小。整體來看，在一定的時間段內(nèi)，高溫對SBEⅡa蛋白酶活性起到促進(jìn)作用，而隨著時間的延長，其活性反而逐漸降低，但還是保持在一個相對較高的水平。

圖5 不同處理下兩個青稞品種的SBEⅡa蛋白酶活性

低溫處理后(圖5)，喜馬拉雅2號和康青1號葉片SBEⅡa蛋白酶活性均在處理10 h 時達(dá)到最大，喜馬拉雅2號在處理2 h時最小，康青1號在處理48 h時最小。整體分析表明，兩個品種葉片中SBEⅡa蛋白酶活性都隨著時間的增加而逐漸增加，在達(dá)到一個頂峰后又開始逐漸下降，呈現(xiàn)一種先升后降的變化趨勢。

鹽脅迫處理后(圖5)，喜馬拉雅2號葉片中SBEⅡa蛋白酶活性在4 h 時達(dá)到最大，在48 h 時最?。豢登?號葉片中SBEⅡa蛋白酶活性在8 h 時達(dá)到最大，在2 h 時最小。根據(jù)兩個材料蛋白酶活差異的變化可以推測喜馬拉雅2號對鹽脅迫的敏感性在處理的前期階段要高于康青1號，而在4 h 后康青1號對鹽脅迫的耐受性要高于喜馬拉雅 2號。

3 討 論

淀粉分支酶基因克隆已在豌豆[17]、水稻[18]、玉米[19]、大麥[20]等植物中展開，但是青稞中關(guān)于淀粉分支酶的克隆還未見報道。本實驗克隆了青稞葉片中SBEⅡa基因并于已經(jīng)克隆的SBEⅡa基因進(jìn)行序列比對發(fā)現(xiàn)，與大麥SBEⅡa基因的序列相似性最高，其次與小麥的相似性也達(dá)到97%，而與其他植物的序列相似性最低為72%。

本研究在克隆得到青稞葉片中SBEⅡa基因的基礎(chǔ)上，設(shè)置了高溫、低溫和鹽脅迫的環(huán)境，利用qRT-PCRPCR技術(shù)結(jié)合淀粉分支酶活性測定試劑盒對SBEⅡa基因和SBEⅡa蛋白酶活性的變化進(jìn)行了分析，結(jié)果表明不同處理條件下SBEⅡa基因的變化與其蛋白酶活性的變化具有一致性。這與譚彩霞等[21]和王自布[22]等人的研究結(jié)果具有一定的一致性，而與楊 毅等[23]人的研究結(jié)果有差異，可能是由于選取的材料不同所致。Takeda等[24]發(fā)現(xiàn) SBEⅡa蛋白酶活性的最適pH為7.5，反應(yīng)的最適溫度為25 ℃。故本試驗中將青稞實驗溫度設(shè)置為低溫4 ℃、高溫37 ℃，同時設(shè)置300 mmol·L-1的鹽脅迫進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在高溫、低溫、鹽脅迫條件下，兩個參試材料葉片中SBEⅡa基因的表達(dá)量變化情況和SBEⅡa蛋白酶活性具有相同的變化趨勢，即隨著處理時間的增加，不同處理條件下SBEⅡa基因表達(dá)量的升高與降低和SBEⅡa蛋白酶活性的升高與降低保持一致。同時，參試的兩個材料葉片中SBEⅡa基因和SBEⅡa蛋白酶活性的變化在相同的處理時間點上也存在一些差異，在一定程度上反應(yīng)了對不同環(huán)境的耐受性和材料之間的差異性。但是兩個材料在不同處理條件下SBEⅡa基因的表達(dá)量和SBEⅡa蛋白酶活性沒有顯著性差異，推測SBEⅡa基因可能在支鏈淀粉的分支形成過程中起輔助作用，在支鏈淀粉中不起主導(dǎo)作用，這一結(jié)果與前人研究結(jié)果一致[25-26]。本實驗研究主要集中在不同環(huán)境下青稞葉片中SBEⅡa基因和蛋白酶活性的變化，后續(xù)可對其在青稞根和籽粒灌漿期中的變化進(jìn)行研究，以便深入的探究SBEⅡa基因在淀粉合成過程中的作用，為改良淀粉的品質(zhì)及育種提供參考。