謝叢薇，張瀟文，楊才瓊，胡寶予，楊 峰，王小春，劉 江，3，楊文鈺，張 靜

（1.農(nóng)業(yè)部西南作物生理生態(tài)與耕作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130；2.四川省作物帶狀復(fù)合種植工程技術(shù)研究中心，成都 611130；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所，成都 611130）

間作套種（復(fù)合種植）是一種集約化的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)模式，能夠提高資源利用率，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)高產(chǎn)高效。近年來，國內(nèi)間套作大豆種植面積不斷擴(kuò)大，創(chuàng)造了良好的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)效益，成為緩解國內(nèi)大豆危機(jī)的生力軍[1]。在間套作系統(tǒng)中，低位作物大豆單側(cè)受到高位作物的遮擋，其地下部單側(cè)土壤含水量低于另一側(cè)，形成了特殊的半根干旱脅迫現(xiàn)象；而大豆對(duì)水分虧缺較敏感，干旱脅迫是制約其生產(chǎn)的主要因素[2-3]?？疾焯厥馍L(zhǎng)環(huán)境中大豆生理代謝和品質(zhì)性狀的變化，對(duì)探究大豆次生代謝產(chǎn)物的抗逆功能，闡明大豆抗旱機(jī)理有重要意義。利用這類異質(zhì)性水分脅迫，延伸形成了根系分區(qū)灌溉技術(shù)，其作為一種新型的農(nóng)業(yè)節(jié)水技術(shù)而備受關(guān)注[4-5]。該技術(shù)使植物不同區(qū)域根系受到交替的水分脅迫，利用根系的吸收補(bǔ)償效應(yīng)及干旱脅迫信號(hào)脫落酸的響應(yīng)調(diào)控，提高植物對(duì)土壤養(yǎng)分和水分的利用率，減少無效的蒸騰耗水及棵間蒸發(fā)[6-7]。根系分區(qū)灌溉技術(shù)已廣泛運(yùn)用在果樹[8-10]、蔬菜[11-13]、糧食作物[14-15]等研究上。劉賢趙等[8]發(fā)現(xiàn)，采用適宜的交替周期對(duì)蘋果樹進(jìn)行分區(qū)灌溉，可在不顯著降低產(chǎn)量的前提下，有效節(jié)水并明顯提升果實(shí)品質(zhì)；分區(qū)灌溉對(duì)根系生長(zhǎng)也有積極作用，合理的交替灌溉方式有利于植物根系構(gòu)型的建成并保持較高的根系活力[9]；王金鳳等[15]也發(fā)現(xiàn)交替1/2 根系區(qū)域灌水能為玉米創(chuàng)造良好的土壤孔隙通氣條件，對(duì)土壤微生物的繁殖也有積極意義；土壤含水量的控制對(duì)光合產(chǎn)物的積累具有重要影響，分區(qū)交替灌溉處理可顯著降低玉米灌漿期穗位葉的蒸騰速率，延緩葉片衰老，從而提高光合速率，有益于弱勢(shì)粒灌漿[5]?？梢姡壳霸谘芯堪敫珊得{迫下作物的外部形態(tài)建成、內(nèi)部響應(yīng)機(jī)制、光合生理特性等方面已取得較大的進(jìn)展，但是少見關(guān)于大豆根系分區(qū)灌溉的報(bào)道。大豆作為一種需水量較大的作物，不同生育階段的水分虧缺對(duì)大豆產(chǎn)量、品質(zhì)均有較大影響[16]。間套作大豆受到高位作物的影響，其根系產(chǎn)生了人為的半根干旱脅迫現(xiàn)象，這種異質(zhì)性脅迫提高了間套作系統(tǒng)的水分利用率，但其對(duì)大豆生理和品質(zhì)性狀的影響尚不清楚。本研究通過室內(nèi)盆栽試驗(yàn)?zāi)M復(fù)合種植模式下大豆生殖生長(zhǎng)期半根干旱脅迫現(xiàn)象，考察了半根交替干旱脅迫對(duì)大豆主要農(nóng)藝性狀的影響；并基于代謝組學(xué)方法，探究了大豆籽?；瘜W(xué)成分受到的影響，以期為大豆抗旱機(jī)理及復(fù)合種植大豆天然產(chǎn)物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料選用耐旱性差異顯著的2 個(gè)大豆品種ND12（耐旱型）和C103（干旱敏感型），由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)作物栽培與耕作學(xué)系提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)于2017年6月在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行，采用兩因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，因素A 為不同大豆品種C103 和ND12；因素B 為不同水分脅迫方式。采用盆栽試驗(yàn)，先于土壤基質(zhì)中育苗，土壤基質(zhì)采用以1∶1 比例混勻并均勻過篩的營養(yǎng)土和田間自然土壤。在子葉展開期（VC 期）將其轉(zhuǎn)移至水培箱中，待其達(dá)到第一復(fù)葉期（V1 時(shí)期）時(shí)，分別取生長(zhǎng)一致的健壯植株8 株，剪掉主根2 cm 以下部分，將須根均勻分為兩部分移植于分根箱中，分根箱為兩格，每格長(zhǎng)265 mm，寬350 mm，高130 mm，并每日正常澆水以保證大豆正常生長(zhǎng)；待植株于分根箱中生長(zhǎng)到全莢期（R4 期）時(shí)，每日 18：00—19：00 測(cè)定土壤水分含量，以土壤含水量低于10%為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)處理組植株實(shí)行兩側(cè)交替澆水100 mL，進(jìn)行半根交替干旱脅迫；對(duì)照組兩側(cè)均正常澆水100 mL，處理組與對(duì)照組澆水頻率保持一致。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目和方法

1.3.1 農(nóng)藝性狀測(cè)定

于大豆完熟期（R8 期）收獲大豆，并分別進(jìn)行考種，測(cè)定株高、莖粗、主莖分枝數(shù)、主莖節(jié)數(shù)、單株莢數(shù)及有效莢數(shù)、單株粒數(shù)、百粒重、單株產(chǎn)量。

1.3.2 代謝組學(xué)分析

樣品制備。大豆籽粒經(jīng)粉樣機(jī)粉碎，過60 目篩，取適量豆粉于鋁盒中，置40℃真空干燥機(jī)干燥24 h，冷卻至室溫；準(zhǔn)確稱量30 mg 豆粉至2 mL 帶蓋離心管中，加入80%甲醇水溶液1.5 mL（料液比1:40）；密封，漩渦震蕩10 s；于冰水浴上超聲（40 kHz，300 W）提取3 h，1 1000 g 離心10 min，取上清液約1.5 mL過0.22 μm 有機(jī)相濾頭至2 mL 進(jìn)樣瓶，即為供試樣品溶液，-20 ℃保存，待上機(jī)檢測(cè)。

LC-MS 分析。測(cè)試方法在本課題組原有方法的基礎(chǔ)上作進(jìn)一步優(yōu)化[1]，采用超高效液相色譜四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC/Q-TOF-MS），其中高效液相系統(tǒng)為（1290 Infinity，Agilent Technologies），質(zhì)譜分析儀器為（6545 Q-TOF LC/MS）。液相條件如下：色譜柱為 Agilent Eclipse Plus-C18 column（50x2.1 mm，1.8 μm），柱溫 35 ℃；流動(dòng)相 A 和流動(dòng)相 B 分別為含0.1%甲酸的乙腈混合溶液和0.1%甲酸水溶液；流速設(shè)為0.300 mL/min，進(jìn)樣量為1 μL；梯度洗脫方案如下：0～4 min，85%～78%；4～10.5 min，78%～61%；10.5 ～13 min，61%～56%；13 ～17.5 min，56%～5%；17.5～20 min，5%～0；20～25 min，0～85%。質(zhì)譜掃描方式：正離子模式掃描，噴霧器壓力20 psig；掃描頻率1 s/spectra；各氣路均使用氮?dú)?，干燥氣流速度?0 L/min，干燥氣溫度為350 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2013 軟件整理數(shù)據(jù)、繪圖；采用GraphPad Prism 7 軟件進(jìn)行差異顯著性分析。使用Agilent-Mass Hunter 工作站軟件，進(jìn)行分子特征提取，采用SIMCA-P 13.0 進(jìn)行偏最小二乘判別分析（PLS-DA），構(gòu)建分類模型；使用 XCMS-online 進(jìn)行數(shù)據(jù)篩選、通路分析[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)藝性狀

對(duì)抗旱性差異顯著的兩個(gè)大豆品種的農(nóng)藝性狀進(jìn)行比較分析，結(jié)果如表1所示。相較于正常灌溉（對(duì)照），半根交替干旱脅迫下，抗性大豆品種ND12 所有農(nóng)藝性狀指標(biāo)均呈現(xiàn)不同程度下調(diào)；單株有效莢數(shù)、分枝數(shù)、單株產(chǎn)量和百粒重的降低幅度最大，分別達(dá)到27.9%、26.7%、24.8%和17.5%。對(duì)于干旱敏感型品種C103 而言，半根交替干旱脅迫下，其單株產(chǎn)量、有效莢數(shù)、百粒重、單株莢數(shù)、單株粒數(shù)也呈現(xiàn)不同程度的下調(diào)，降低幅度分別達(dá)到27.0%、18.7%、15.2%、13.4%和 13.1%；而分枝數(shù)、莖粗、主莖節(jié)數(shù)、株高卻出現(xiàn)小幅上調(diào)，但均未達(dá)到差異顯著水平。對(duì)于多數(shù)農(nóng)藝性狀而言，上述兩個(gè)大豆品種受到半根交替干旱脅迫的影響，其差異并不顯著，僅單株產(chǎn)量和百粒重分別在0.05 和0.01 水平具有顯著差異。

表1 半根交替干旱脅迫對(duì)大豆農(nóng)藝性狀的影響Table 1 Effect of alternating split-root drought stress on the agronomic characters of soybean plant

2.2 代謝組學(xué)分析

基于超高效液相色譜四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC/Q-TOF-MS）一級(jí)質(zhì)譜全掃描模式，共提取得到1744 個(gè)分子特征（molecular feature），將這些分子特征導(dǎo)入SIMCA-P 進(jìn)行最小二乘判別分析 （PLSDA），其得分圖如圖1所示。由圖1可知，供試的4類材料被劃分為3 組，其中主成分 1 將 ND12 和C103 區(qū)分開，而主成分2 將C103 處理組與其正常灌溉對(duì)照區(qū)分開。由此可知，供試的兩個(gè)大豆品種籽粒代謝群體受到半根交替干旱脅迫的影響程度不同：PLS-DA 未能將抗旱性大豆品種ND12 的代謝群體明顯分離，其受到脅迫的影響較??；而干旱敏感型大豆C103 籽粒代謝群體通過PLS-DA 得到了明顯的分離，其受到脅迫的影響較大。

圖1 半根交替干旱脅迫對(duì)大豆籽粒代謝群體的影響（PLS-DA 得分圖）Figure 1 Effect of alternating split-root drought stress on the metabolites of soybean seed （PLS-DA score plot）

同時(shí)，對(duì)不同抗性大豆材料所提取到的分子特征進(jìn)行差異顯著性分析及倍性分析，以對(duì)照處理間差異顯著性P 值≤0.01 及相對(duì)含量倍性變化≥1.5倍為限制條件，從ND12 籽粒中共提取獲得121 個(gè)差異分子特征；在C103 籽粒中共提取獲得511 個(gè)差異分子特征（圖2）。由此可知，C103 中差異代謝物顯著多于ND12，也進(jìn)一步證實(shí)了C103 籽粒受半根交替干旱脅迫影響，其代謝物的變化更為劇烈。將上述差異分子特征投射到色譜圖中（圖2），可以看出，不同抗性大豆受到脅迫，其籽粒代謝物的變化差異主要存在于高極性部分（0～5 min），且主要以上調(diào)為主；由此推測(cè)敏感型大豆C103 受到半根交替干旱脅迫影響，其高極性化合物含量可能增加。

進(jìn)一步地，對(duì)篩選獲得的在C103 處理-對(duì)照間具有顯著差異的分子特征的精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索和定性分析，并對(duì)這些差異代謝物進(jìn)行通路分析，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，C103 籽粒中受到半根交替干旱脅迫影響最大的代謝通路為大豆皂苷合成（soybean saponin I biosynthesis）、丙酮醛降解（methylglyoxal degradation I）、 木質(zhì)素糖苷合成（monolignol glucosides biosynthesis）及苯丙氨酸合成（phenylpropanoid biosynthesis）通路（圖3-b）。

圖2 差異分子特征分布圖Figure 2 Cloud plots of significant different molecular features

C103 籽粒受半根交替干旱脅迫影響，差異代謝物的相對(duì)含量變化情況如圖4所示。由圖4可知，受到脅迫后，C103 籽粒皂苷合成通路上調(diào)，其中以大豆皂苷B（soyasapogenol B）、大豆皂苷B-3-O-葡萄糖苷（soyasapogenol B-3-O-β-glucuronide）、大豆皂苷 I（soyasaponin I）、大豆皂苷 III（soyasaponin III）的相對(duì)含量增加最顯著；丙酮醛降解通路上調(diào)，主要涉及（R）-S-乳酰谷胱甘肽（（R）-S-lactoylglutathione）和谷胱甘肽（glutathione）含量的顯著上升；木質(zhì)素糖苷合成通路上調(diào)，主要涉及二羥基松柏醇（dihydroconiferyl alcohol）、芥子醛（sinapaldehyde）和芥子醛葡萄糖苷（sinapaldehyde glucoside）含量的顯著上升；苯丙氨酸合成通路上調(diào)，主要涉及4-酰基莽草酸酯（4-coumaroylshikimate）、松柏醇（coniferyl alcohol）、芥子醛（sinapaldehyde）和p-?；鼘幩幔╬-Coumaroyl quinic acid）含量的顯著上升。

圖3 C103 籽粒差異代謝物通路分析Figure 3 Pathway analyses of different metabolites in C103 seeds

圖4 C103 籽粒差異代謝物箱式圖Figure 4 Box and whisker plots of the significantly different metabolites in C103 seeds

3 討論與結(jié)論

大豆需水量多，水分虧缺會(huì)制約其生長(zhǎng)發(fā)育，在苗期、花莢期及鼓粒成熟期對(duì)其產(chǎn)量構(gòu)成因素產(chǎn)生不同的影響。本研究對(duì)不同的灌溉方式下，兩個(gè)耐旱性差異顯著的大豆品種ND12 （耐旱型）和C103（干旱敏感型）的多項(xiàng)農(nóng)藝性狀進(jìn)行了對(duì)比分析。兩個(gè)品種大豆的產(chǎn)量指標(biāo)均受到嚴(yán)重影響的原因可能是，結(jié)莢期干旱導(dǎo)致大豆生殖器官水勢(shì)降低，從而抑制了豆莢的生長(zhǎng)[18]；而半根交替干旱脅迫下，供試大豆單株莢數(shù)、有效莢數(shù)和單株粒數(shù)的大幅降低也證實(shí)了該推斷；結(jié)莢期干旱對(duì)大豆后期的生物量及其分配會(huì)產(chǎn)生較大影響，干旱降低了大豆收獲指數(shù)[19]。

兩個(gè)大豆品種的籽粒代謝組學(xué)分析表明，干旱敏感型大豆籽?；瘜W(xué)成分對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)更加劇烈，這或可以通過籽粒代謝群體的變化情況，為抗旱性大豆種質(zhì)資源的篩選提供參考，這在耐蔭型大豆品種的選育中有類似的報(bào)道[17]。大豆皂苷為齊墩果烷型三萜皂苷，具有增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)功能、抗腫瘤、抗氧化、抗炎癥、抗糖尿病和調(diào)節(jié)腦血管系統(tǒng)等多種功能，是大豆籽粒的主要活性成分之一[20]。谷胱甘肽是一種由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成的天然活性肽，具有清除自由基、解毒等重要的生理功能[21]；其在還原硫的貯存和運(yùn)輸、蛋白質(zhì)合成及植物抗逆性方面均有重要作用，抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)系統(tǒng)是植物體內(nèi)清除自由基的重要途徑[22]，在植物抗逆性方面均有重要作用[23]。半根干旱脅迫下，雖然大豆產(chǎn)量性狀降低，但大豆皂苷和谷胱甘肽等重要品質(zhì)性狀均呈顯著上調(diào)趨勢(shì)；未來有望通過適度的半根干旱栽培模式，在維持大豆正常生長(zhǎng)的前提下，提高大豆皂苷及谷胱甘肽等功能性成分含量。

另外，木質(zhì)素代謝是苯丙烷代謝通路的重要支路，受到脅迫后，大豆籽粒的木質(zhì)素糖苷合成通路及苯丙氨酸合成通路顯著上調(diào)；其背后涉及到的松柏醇、芥子醛等代謝產(chǎn)物均為木質(zhì)素合成的中間產(chǎn)物，這表明，半根交替干旱脅迫下，大豆籽粒木質(zhì)化程度加劇。木質(zhì)素作為一種天然高分子聚合物，與細(xì)胞壁中的纖維素、 半纖維素等多糖分子相互交聯(lián)，增加了植物細(xì)胞和組織的機(jī)械強(qiáng)度，對(duì)細(xì)胞壁的機(jī)械支持特性具有重要作用[24]；半根交替干旱脅迫下大豆籽粒木質(zhì)化程度的加劇可能是大豆實(shí)現(xiàn)其代際間非生物脅迫應(yīng)對(duì)策略的重要組成部分，這還有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)通過對(duì)處理組植株采用兩側(cè)交替澆水實(shí)現(xiàn)半根干旱脅迫，對(duì)照組正常澆水且與處理組澆水頻率保持一致，保證了對(duì)照組與處理組澆水側(cè)的土壤田間持水量基本處于同一水平。但分區(qū)交替澆水量的設(shè)計(jì)比較單一，未考慮到部分干旱的情況，給予了植株一側(cè)根系完全的干旱，可能對(duì)大豆的正常生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生了不利影響。未來將設(shè)置梯度式灌水量，通過多個(gè)水分處理組合明確最適宜植株生長(zhǎng)的分區(qū)交替處理。

兩個(gè)品種間各項(xiàng)指標(biāo)的變化趨勢(shì)存在差異，與正常灌溉相比，半根交替干旱脅迫下，抗性品種ND12 受到的影響相對(duì)更大，其株高、莖粗、分枝數(shù)、主莖節(jié)數(shù)等各項(xiàng)外觀性狀呈下降趨勢(shì)，但均未達(dá)到差異顯著水平；而敏感型品種C103 卻出現(xiàn)了小幅增長(zhǎng)。產(chǎn)量性狀方面，兩個(gè)大豆品種的百粒重均極顯著降低，單株產(chǎn)量顯著降低，且ND12 的降幅低于C103。

代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，C103 籽粒中的差異代謝物顯著多于ND12，變幅更大，表明干旱敏感型大豆籽粒化學(xué)成分對(duì)脅迫的響應(yīng)更劇烈；其中幾種差異代謝物的相對(duì)含量變化顯示，籽粒中皂苷合成通路及丙酮醛降解通路呈上調(diào)趨勢(shì)，大豆皂苷和谷胱甘肽等重要品質(zhì)性狀均顯著提升。木質(zhì)素糖苷合成通路上調(diào)，松柏醇、芥子醛等相對(duì)含量顯著上升，表明C103 籽粒的木質(zhì)化程度加劇。