劉江，王振興，闞歡，李正東，韓強，穆宏磊，郜海燕，彭明順，張雪春*

1(西南林業(yè)大學 生命科學學院，森林食品研究院，云南 昆明，650224)2(浙江省農業(yè)科學院食品科學研究所，農業(yè)農村部果品采后處理重點實驗室，浙江 杭州，310021)3(大姚縣三臺綠特食品開發(fā)有限責任公司，云南 楚雄，675400)

核桃花又稱核桃紐、長壽菜、龍須菜，是核桃種植生產的主要副產物之一，每株成熟的核桃樹可產4～5 kg核桃花[1-2]。中國是世界上核桃生產大國，核桃的種植面積和產量均居世界上首位。截止2017年底，我國核桃栽培面積已達1億畝，核桃產量414萬t，可產核桃花50萬t，其中僅云南種植面積就達4 300萬畝，可產核桃花20萬t。

核桃花具有較高的開發(fā)價值[3],蛋白質高達21%，K、Fe、Mn、Zn、Se及β-胡蘿卜素、核黃素、抗壞血酸、維生素E等含量較高，氨基酸組成全面、豐富[3-4]。此外，核桃花還具有較強的生物活性，如核桃花的甲醇提取物具有較強的抗氧化活性、抗菌活性[5-7]以及抗溶血活性[8]；其乙醇提取物可以預防糖尿病大鼠的肝損害、降低其血糖水平[9-10]、抑制腫瘤細胞增殖[11-13]等。我國民間一直有藥用和食用核桃花的傳統(tǒng)，并將其稱為長壽食品。貴州省和云南省少數(shù)民族地區(qū)將核桃花作為特色蔬菜，其制作的菜肴氣味清香，口感鮮嫩清脆。

但目前我國對核桃花的開發(fā)利用較少，除少量食用和飼用外，大部分都被丟棄。核桃花中富含生物活性物質，在加工過程中極易發(fā)生褐變，導致產品感官品質下降，營養(yǎng)物質損失[14]，嚴重影響核桃花的商品價值。為提高核桃花的產品質量和經(jīng)濟效益，需要對其進行護色處理[15-16]。本實驗旨在篩選出適合核桃花護色的護色劑，并優(yōu)化護色工藝，為開發(fā)利用核桃花資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃花，購于云南楚雄大姚縣。乙酸鋅(Zn(Ac)2)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)、Na2CO3、抗壞血酸(VC)、CaCl2、L-半胱氨酸(L-Cysteine)等，均為食用級。

SC-80型輕便色彩色差計，北京康光儀器有限公司；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海齊欣科學儀器有限公司；BSA224S型電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；UV-1000紫外可見分光光度計，北京萊伯泰科技儀器有限公司；XA-3型樣品粉碎機，常州市春秋電子儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 護色

將核桃花以清水沖洗2遍，然后在配置好的護色劑溶液中護色一定時間，取出瀝干表面水分，在50 ℃下干燥3 h，然后密封于室溫下待用。

1.2.2 色差值(ΔE)的測定

準確稱取護色后干燥的核桃花1.0 g，剪碎，加入20 mL去離子水，研磨成漿，過濾，收集濾液，采用輕便色彩色差計測量核桃花濾液的L*，a*，b*值。L*代表樣品的明度，L*值越大，顏色越白；a*代表樣品的紅綠值，其中+a*為紅，-a*為綠；b*代表樣品的黃藍值，其中+b*為黃，-b*為藍，由護色前后樣品的L*，a*，b*的差值ΔL、Δa、Δb，可計算出樣品的總色差值ΔE[17]。ΔE可表示樣品的色澤變化程度，ΔE值越大，色澤變化越大，護色效果越差。ΔE的計算見公式(1)[18]：

(1)

式中:ΔL、Δa、Δb分別為護色前后樣品L*，a*，b*的差值。

1.2.3 褐變強度(BD)的測定

采用消光值法[19-20]。取1.2.2中收集的濾液，采用分光光度計法在410 nm處測量吸光度值A410，結果以A410×10表示褐變程度。

1.2.4 護色劑的確定

分別選用了3 mg/mL Zn(Ac)2、EDTA-2Na、Na2CO3、VC、CaCl2、L-Cysteine，對核桃花進行護色試驗，同時以不加護色劑的去離子水為空白對照，測定色差值和褐變強度，選取護色效果較好的幾種單護色劑，然后進行復配試驗，以確定最佳護色劑組合。

1.2.5 單因素試驗

以1.2.4中確定的最佳護色劑組合，分別考察護色劑質量濃度(0.5、1.0、3.0、5.0、8.0、10.0、12 mg/mL)、護色時間(1、2、4、6、8、10 h)、護色溫度(15、25、40、60、80、100 ℃)對核桃花護色效果的影響。

1.2.6 Box-Benhnken中心組合實驗設計

在單因素試驗的基礎上，建立3因素3水平的Box-Benhnken中心組合試驗[21]，以色差值、褐變強度為響應值，各因素的3個水平采用-1、0、1進行編碼，如表1。

表1 響應曲面設計實驗因素水平和編碼表Table 1 Independent variables and their levels used in the response surface design

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組參數(shù)均設置3組重復，試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差的形式表示，采用SPSS Statistics 19軟件進行差異顯著性分析，運用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面設計，并由Origin 7.5軟件繪制試驗結果圖。

2 結果與分析

2.1 護色劑的確定

2.1.1 單一護色劑的護色效果

各護色劑對核桃花的護色效果見表2。相同濃度下，各處理組ΔE大小順序為：CaCl20.05)，這表明Na2CO3和L-Cysteine不適合作為核桃花的護色劑。CaCl2組提高核桃花護色效果的原因可能是由于Ca2+的存在，與核桃花細胞壁上的果膠酸作用形成了果膠酸鈣，增大組織的硬度，阻止液泡中的組織外滲，抑制與酶類的接觸，從而降低了褐變程度[22]；EDTA-2Na在食品加工中能減慢原料固有色素的褪色速度，保持其穩(wěn)定性[23]；Zn(Ac)2的Zn2+具有絡合能力，它同多酚底物結合后產生的新型物質不受多酚氧化酶的催化，抑制了核桃花的褐變[15]；Vc不僅可以改變體系的pH值，同時還是一種強還原劑[24]，其抑制褐變的主要原因是Vc將核桃花中的鄰二醌還原成鄰二酸[25-26]。綜合ΔE與褐變強度試驗結果，Vc、Zn(Ac)2、EDTA-2Na、CaCl2組的護色效果均優(yōu)于其他2種護色劑，因此選用這4種護色劑進行下一步復配試驗。

表2 單一護色劑的護色效果Table 2 Effects of single browning inhibitors on walnut flower color

注：同一列不同小寫字母上標表示差異顯著性(P<0.05)。

2.1.2 復合護色劑的護色效果

復合護色劑對核桃花的護色效果見表3。相同濃度下，兩兩復配的復合護色劑護色效果普遍優(yōu)于三三復配的復合護色劑。兩兩配對的復合護色劑ΔE的大小依次是：EDTA-2Na+CaCl2

表3 復合護色劑的護色效果Table 3 Effects of complex browning inhibitors on Walnut flower color

注：復合護色劑的比例均為質量比；同一列不同小寫字母上標表示差異顯著性(P<0.05)。

2.2 單因素試驗

2.2.1 護色劑濃度對核桃花護色效果的影響

復合護色劑濃度對核桃花的護色效果見圖1。

圖1 護色劑濃度對核桃花護色效果的影響Fig.1 Effect of concentration of browning inhibitors on the color protection effect of walnut flower

由圖1可知，隨著護色劑濃度的增加，護色效果呈先下降后增加的趨勢。當護色劑質量濃度小于3 mg/mL時，色差值和褐變強度逐漸降低；質量濃度在3～8 mg/mL時，色差值和褐變強度基本呈直線狀，趨于穩(wěn)定；當護色劑質量濃度達到5 mg/mL時，色差值和褐變度均達到最小值，此時護色效果最佳；質量濃度在8～12 mg/mL時，色差值和褐變強度又有所上升。原因可能是隨著Ca2+和EDTA-2Na質量濃度增加，其抑制褐變能力增強；但當護色劑濃度過大時，產生的果膠酸鈣過多導致護色效果變弱。因此選取5 mg/mL為最佳護色質量濃度。

2.2.2 護色時間對核桃花護色效果的影響

護色時間對核桃花的護色效果見圖2。由圖2可知，隨著護色時間的延長，核桃花的褐變度沒有顯著變化(P>0.05)，但色差值呈逐漸增大的趨勢。這可能是由于在護色開始時護色劑對核桃花中各種酶類以及維生素等起到了抑制作用，但隨著護色時間的延長，核桃花中的酶類發(fā)生酶促褐變，多酚、維生素等與氧氣接觸發(fā)生了非酶褐變，導致后期顏色的逐漸變化。因此選擇2 h為最佳護色時間。

圖2 護色時間對核桃花護色效果的影響Fig.2 Effect of color protection time on the color protection effect of walnut flower

2.2.3 護色溫度對核桃花護色效果的影響

圖3 護色溫度對核桃花護色效果的影響Fig.3 Effect of color protection temperature on the color protection effect of walnut flower

由圖3可知，隨著護色溫度的升高，護色效果總體呈先下降后上升的趨勢。當護色溫度為25 ℃時其色差值和褐變度均達到最小值，這可能是由于高溫會破壞核桃花中的葉綠素，導致其顏色變深。因此選擇25 ℃為最佳護色溫度。

2.3 Box-Benhnken中心組合試驗結果及數(shù)據(jù)分析

2.3.1 Box-Benhnken中心組合試驗設計方案及結果

根據(jù)單因素試驗結果，以核桃花色差值、褐變度為響應值，以護色劑濃度(A)、護色時間(B)、護色溫度(C)為自變量，采用Design-Expert 8.0.6軟件建立3因素3水平中心組合試驗，其試驗方案和結果如表4所示。

表4 Box-Behnken試驗設計和結果Table 4 Box-Behnken design and results

2.3.2 回歸方程擬合及方差分析

通過Design Expert 8.0.6軟件對表4中試驗結果進行響應面回歸分析，得到該實驗的回歸模型方程Y1=11.90+0.33A-5.90B-0.08C-0.12AB-2.37AC+0.05BC-0.02A2+1.23B2+5.47E-4C2、Y2=2.61-0.26A-0.50B-0.06C+0.03AB-4.48E-3AC+3.79E-3BC+0.03A2+0.06B2+1.42E-3C2。響應值Y1、Y2模型系數(shù)顯著性結果和方差分析結果見表5。

表5 回歸模型方差分析和系數(shù)顯著性檢驗Table 5 Variance analysis and significance test of regression model

2.3.3 響應面圖分析

根據(jù)響應值的3D曲面圖，分析各因素對核桃花護色效果的影響及各因素的交互作用。圖4中所示為因素的交互作用及對核桃花護色效果的影響。其中圖4-c和圖4-e曲面相對陡峭說明因素之間的交互作用較明顯，與方差分析結果相符。

a-護色劑濃度與護色時間對色差值影響的響應面圖；b-護色劑濃度與護色溫度對色差值影響的響應面圖；c-護色時間與護色溫度對色差值影響的響應面圖；d-護色劑濃度與護色時間對褐變程度影響的響應面圖；e-護色劑濃度與護色溫度對褐變程度影響的響應面圖；f-護色時間與護色溫度對褐變程度影響的響應面圖圖4 兩因素的交互作用對護色效果的響應面圖Fig.4 Response surface plots of variable parameters on the color protection effect

2.3.4 試驗驗證

采用Design Expert軟件同時對2個方程求導可知，當護色劑濃度為5.23 mg/mL、護色時間為2.3 h、護色溫度為25.5 ℃時，其理論色差值和褐變度均最低，分別為4.86和0.54，護色效果最佳。對該優(yōu)化條件進行驗證試驗，平行3次，在該條件下色差值為4.84、褐變度為0.49，接近理論值，證明該模型可行。

3 結論

考察了實際生產中常用的幾種護色劑對核桃花的護色效果，發(fā)現(xiàn)EDTA-2Na與CaCl2按1∶1復配后的護色效果最佳。

采用Design Expert軟件對核桃花護色工藝進行優(yōu)化，得到了核桃花護色的最佳工藝：復合護色劑濃度為5.23 mg/mL、護色時間為2.3 h、護色溫度為25.5 ℃。此條件下的核桃花護色效果最佳，其色差值和褐變度最低，分別為5.26和0.49。本研究為抑制核桃花的褐變現(xiàn)象提供了一定的參考價值，對其加工利用有一定幫助。

核桃花富含豐富的營養(yǎng)物質和活性組分，但其在護色過程中各營養(yǎng)物質和活性組分是否發(fā)生變化尚不可知，下一步將在護色工藝對核桃花的營養(yǎng)和功能活性等影響做深入研究。