程 燁 呂春曉 李貴鳳 陶貴渝 陳建偉 李 煌

成骨細(xì)胞是骨形成的效應(yīng)細(xì)胞，在骨改建的機(jī)制中處于“中心調(diào)控地位”，被認(rèn)為是力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中對應(yīng)力應(yīng)變信號進(jìn)行感知的主要力學(xué)敏感性細(xì)胞。許多研究顯示，體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞在機(jī)械應(yīng)力刺激下會發(fā)生基因表達(dá)的改變。應(yīng)力刺激在1小時內(nèi)就能增加成骨細(xì)胞環(huán)氧合酶2（COX-2）和c-fos mRNA 的表達(dá)水平[1]，24 小時內(nèi)可提升其細(xì)胞外基質(zhì)蛋白骨鈣素（OCN）及骨橋蛋白的表達(dá)[2]。

轉(zhuǎn)化生長因子β（TGFβ）是一類強(qiáng)力的多功能細(xì)胞因子，其主要的生理功能可能包括調(diào)控細(xì)胞的生長，刺激基質(zhì)的分泌及免疫抑制。在牽張成骨過程中，TGFβ 是重要的參與者。在多項動物頜骨牽張實驗中發(fā)現(xiàn)，TGFβ1 表達(dá)在延遲期、牽張期和早期固定期均有增加[3]。本課題組的前期研究通過生長期山羊骨縫牽張的實驗發(fā)現(xiàn)，骨縫邊緣出現(xiàn)大量成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞，BMP 和TGFβ 在這些增殖活躍的細(xì)胞中呈高水平表達(dá)[4]。體外研究發(fā)現(xiàn)，由破骨細(xì)胞釋放激活的TGFβ 可以通過活化成骨前體細(xì)胞并刺激其增殖而增加成骨細(xì)胞的數(shù)量來刺激骨的形成[5，6]。

成骨細(xì)胞中Ⅰ型膠原（COL-I）的表達(dá)始于增殖期，基質(zhì)合成期達(dá)到高峰；堿性磷酸酶（ALP）是成骨細(xì)胞早期分化標(biāo)志物，基質(zhì)合成期開始表達(dá)，鈣化期達(dá)到高峰；OCN 是成骨細(xì)胞成熟標(biāo)志，從鈣化早期開始表達(dá)，鈣結(jié)節(jié)成熟后達(dá)高峰。功能性Runx2 水平?jīng)Q定了骨骼成熟程度及轉(zhuǎn)換率。Runx2 存在于增殖活躍的成骨細(xì)胞細(xì)胞前體中，并在細(xì)胞開始分化時表達(dá)最高，Runx2 通過使細(xì)胞退出細(xì)胞周期和激活骨細(xì)胞表型基因促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟[7，8]。因此，OCN、COL-I、ALP 和Runx2 是判定成骨細(xì)胞功能活性的重要指標(biāo)。

大鼠腭中縫牽張實驗顯示，骨改建活躍區(qū)域細(xì)胞TGFβ/Smad 信號分子表達(dá)水平發(fā)生變化[9]。然而，在此過程中，各類細(xì)胞的功能活動改變及機(jī)制仍未得到全面詳細(xì)的描述。為了更深入的了解這一系列細(xì)胞分子事件的機(jī)械感應(yīng)機(jī)制，我們對機(jī)械張應(yīng)力作用下成骨細(xì)胞增殖活性，TGFβ/Smad、OCN、COL-I、ALP 和Runx2 等表達(dá)變化規(guī)律及可能機(jī)制進(jìn)行了研究。

資料和方法

1.成骨細(xì)胞體外張應(yīng)力加載模型：本實驗使用的成骨細(xì)胞為MC3T3-E1 小鼠成骨細(xì)胞株，在含10%胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。

成骨細(xì)胞按4x105/ml 密度接種于消毒后的加力板中心區(qū)域，48 小時后，將培養(yǎng)基換為無血清的α-MEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 小時，以同步化成骨細(xì)胞細(xì)胞周期。

采用Focrel 四點彎曲體外細(xì)胞加力儀器，頻率為0.5Hz，加力板變形量為2000μstrain，按0h（未加力），lh，3h，6h，12h，24h 不同時間，使細(xì)胞發(fā)生單軸牽張應(yīng)變（圖1），加力結(jié)束后按組收集細(xì)胞。對照組細(xì)胞不加力。

圖1 Focrel 四點彎曲體外細(xì)胞加力裝置

2.成骨細(xì)胞增殖活性分析：各組細(xì)胞加力結(jié)束后，取出加力板，消化收集加力板上的成骨細(xì)胞并固定。釆用流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter）檢測細(xì)胞DNA 含量，計算各樣本中 G0/G1 期、S 期、G2/M 期細(xì)胞百分比。增殖指數(shù)（PI）反映了細(xì)胞群體的增殖活性和DNA 合成速度，分別計算各組的PI 值。PI＝（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）×100%

3.TGFβ/Smad 及成骨分化相關(guān)因子表達(dá)檢測：①細(xì)胞總RNA 提?。喊凑誘RIzol 試劑盒（Invitrogen公司，美國）說明書步驟進(jìn)行細(xì)胞總RNA 的提取，提取所得的總RNA 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢合格后備用。②引物設(shè)計與合成：根據(jù)GeneBank 中小鼠TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβR Ⅰ 、TGFβR Ⅱ 、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7、OCN、ALP、COL-I 和Runx2 基因和GAPDH 管家基因序列設(shè)計引物，引物由生工生物工程（上海）有限公司設(shè)計合成（表1）。③逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：采用Takara PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser 試劑盒（Takara公司，日本）在FTC2000PCR 合成儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。④實時聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）：采用 Takara SYBR? Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）試劑盒（Takara 公司，日本）配置反應(yīng)體系，在ABI PRISM ? 7300 Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystems 公司，美國）進(jìn)行檢測，擴(kuò)增條件均為：95℃，30s（預(yù)變性）；95℃，5s，60℃，31s，40個循環(huán)（PCR 反應(yīng)）。⑥統(tǒng)計分析：實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示。采用SPSS17.0 軟件包，對PCR 結(jié)果在各個時間點進(jìn)行單因素方差分析，并在此基礎(chǔ)上應(yīng)用LSD 法進(jìn)行兩兩比較，規(guī)定P＜0.05 有統(tǒng)計學(xué)差異。

表1 RT-PCR 引物序列

結(jié) 果

1. 成骨細(xì)胞增殖活性：隨著加力時間的增加，G0/G1 期細(xì)胞所占比例呈下降趨勢；S 期細(xì)胞比例在1h，3h，6h 組呈上升趨勢，12h 組出現(xiàn)明顯下降，而24h 組比上一階段明顯增高；G2/M 期細(xì)胞比例在1h，3h，6h 組不斷減小，12h 組明顯升高，但24h 組再次降低（圖2）。

PI 指數(shù)隨應(yīng)力加載時間增加而呈上升趨勢。除1h 與3h 組外，其他各時間點間PI 指數(shù)差異均具統(tǒng)計學(xué)意義。0h，1h，3h 加力組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，6h，12h，24h 組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2）。

圖2 張應(yīng)力加載不同時間點細(xì)胞周期及增殖指數(shù)變化

2. 總RNA 樣本質(zhì)檢結(jié)果：各組總RNA 樣品28S、18S、5S 三條帶清晰，OD260/OD280 比值均介于1.9 至2.0 之間，表明RNA 有良好的完整性和純度，無降解及蛋白質(zhì)等污染，符合逆轉(zhuǎn)錄要求（圖3）。

3. 機(jī)械張應(yīng)力刺激下成骨細(xì)胞ALP、OCN、Runx2、COL-I 及TGFβ/Smad mRNA 的表達(dá)：成骨細(xì)胞在受力3h、6h 后，其TGFβ1 mRNA 表達(dá)水平持續(xù)上升，受力12h 后，略有下降但仍明顯高于0h對照組，加力24h 后，其表達(dá)達(dá)到頂峰。TGFβ2 mRNA 表達(dá)水平在加力3h 后明顯上調(diào)，但6h 組，其表達(dá)與0h 對照組持平，12h、24h 組其表達(dá)再次上升。TGFβ3 mRNA 的表達(dá)一直持續(xù)在較低的水平，加力6h，其表達(dá)明顯降低，12h 時略高于對照組，但24h 組再次下降。TGFβRⅠ的基因表達(dá)在加力3h后顯著上升，6h 時受到明顯抑制而下調(diào)，但隨著加力時間的延長，其表達(dá)再次升高，24h 時，達(dá)到高峰。TGFβRⅡ的表達(dá)變化趨勢與TGFβRⅠ類似，即6h時受到抑制，但其24h 組的表達(dá)低于12h 組（圖4）。

Smad2、3 具有一致的表達(dá)變化規(guī)律，即加力后3h，表達(dá)均上調(diào)，6h 時其表達(dá)水平與0h 對照組無差異，隨著加力時間的增加，其表達(dá)水平持續(xù)上調(diào)，且Smad3 的表達(dá)水平在24h 組明顯升高。Smad4 在短時加力組的表達(dá)水平與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異，但仍有3h 組表達(dá)上升，6h 組受抑制的趨勢，在12h，24h組，其表達(dá)明顯上調(diào)。Smad7 在加力各時間點均有較高表達(dá)，其高峰位于3h 組。隨后逐漸降低，24h 時，略有回升（圖4）。

ALP、OCN、Runx2 和COL-I 在加力后3h，基因表達(dá)明顯上調(diào)均高于對照組，但6h 時，其表達(dá)受到不同程度的抑制，隨著加力時間的增加，其mRNA表達(dá)水平呈上升趨勢且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組（圖4）。

圖3 各組總RNA 電泳質(zhì)檢

圖4 張應(yīng)力加載不同時間點成骨細(xì)胞TGFβ/Smad、ALP、OCN、Runx2 及COL-I mRNA 表達(dá)變化（*表示與對照組有統(tǒng)計學(xué)差異）

討 論

在外界機(jī)械力刺激下，成骨細(xì)胞的反應(yīng)是骨組織發(fā)生骨改建及再生重建的源泉。成骨細(xì)胞是對應(yīng)力應(yīng)變信號進(jìn)行感知轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要力學(xué)敏感細(xì)胞，可以通過多種途徑感受體內(nèi)外力學(xué)刺激，并將其轉(zhuǎn)化為生物化學(xué)信號，介導(dǎo)力相關(guān)敏感基因的表達(dá)，合成各種酶類等活性物質(zhì)，從而激活信號網(wǎng)絡(luò)級聯(lián)反應(yīng)，促成一系列復(fù)雜的生理病理活動[10]。因此，了解成骨細(xì)胞的生物學(xué)行為，尤其是在機(jī)械應(yīng)力作用下，其行為的變化規(guī)律及機(jī)制，對于我們研究機(jī)械力作用下，骨骼的改建及再生，具有極其重要的意義。

關(guān)于應(yīng)力刺激對細(xì)胞增殖周期的影響，經(jīng)過無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h 后，大部分細(xì)胞位于G0/G1期。隨著加力時間的增加，處于G0/G1 期的成骨細(xì)胞比例逐漸下降，提示在這一過程中，進(jìn)入細(xì)胞周期的細(xì)胞逐漸增加。加力24h 后，仍有約50%的細(xì)胞處于G0/G1 期，這部分細(xì)胞可能與維持生物學(xué)功能有關(guān)。加力1h，3h，6h 后，S 期細(xì)胞比例穩(wěn)定增加，說明在短時應(yīng)力刺激下，細(xì)胞的DNA 合成復(fù)制增加。12h 組中，S 期細(xì)胞明顯減少而G2/M 期細(xì)胞比例上升，說明在應(yīng)力加載12h 后，細(xì)胞順利進(jìn)入了分裂期。24h 組，S 期細(xì)胞比例再次增加，提示細(xì)胞進(jìn)入了下一次的有絲分裂期。PI 指數(shù)顯示，隨著張應(yīng)力加載時間的增加，細(xì)胞的增殖活性增強(qiáng)。但1h 和3h組PI 指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，證明在短時應(yīng)力刺激下，細(xì)胞的增殖活性變化不明顯，故在后續(xù)研究中，我們采用了0h，3h，6h，12h 和24h 作為觀察點。

TGFβ 信號通路在軟骨內(nèi)成骨的形成中具有十分重要的作用。Smad 分子作為TGFβ 在細(xì)胞內(nèi)的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，其在成骨細(xì)胞中的表達(dá)及機(jī)制的報道遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于TGFβ 及其受體。本研究結(jié)果顯示，張應(yīng)力作用下3h 組成骨細(xì)胞TGFβ1、2 表達(dá)上調(diào)，而TGFβ3 的表達(dá)無明顯變化。加力6h 后，TGFβ1 仍維持較高的表達(dá)水平，而TGFβ2、3 的表達(dá)則受到了明顯的抑制。隨著加力時間的延長，TGFβ1、2 的表達(dá)回升，并高于對照組，而TGFβ3的表達(dá)仍處于較低水平。對成骨樣細(xì)胞的體外培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)，TGFβ 對其具有直接的、強(qiáng)有力的趨化作用，同時，TGFβ 是強(qiáng)有力的有絲分裂原， 能刺激成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和膠原合成增加并抑制其降解[11～14]。結(jié)合本實驗結(jié)果，我們推測：TGFβ1、2 對于成骨細(xì)胞在機(jī)械力刺激下增殖活性的增加具有十分重要的作用，尤其是TGFβ1，其表達(dá)規(guī)律與細(xì)胞S 期比例的增加趨勢基本一致。而TGFβ2 除在6h 組表達(dá)下降外，在其余各加力時間點均維持較高的表達(dá)水平。顱骨縫組織塊體外實驗證實，外源性TGFβ1、2 能促進(jìn)骨縫細(xì)胞增殖、成骨，并最終導(dǎo)致其閉合；而外源性TGFβ3 則會降低細(xì)胞DNA 的合成，維持骨縫的開放，在去除TGFβ3 后，細(xì)胞DNA 合成增強(qiáng)，骨縫融合[15]。由于顱骨縫的發(fā)育主要為膜內(nèi)成骨，因此我們可以推斷，在應(yīng)力刺激下，成骨細(xì)胞TGFβ1、2 的高表達(dá)是其增殖指數(shù)上升的原因之一。而TGFβ3 的低表達(dá)也印證了其雖然與TGFβ1、2 使用同樣的受體，卻具有不同的生物學(xué)效應(yīng)。

TGFβRⅠ、Ⅱ的表達(dá)趨勢與其配體基本一致。體內(nèi)及體外研究發(fā)現(xiàn)，TGFβRⅠ的失活會導(dǎo)致成骨細(xì)胞早期分化標(biāo)志物Runx2、Osterix 和ALP 表達(dá)的降低。Smad2、3 具有類似的表達(dá)規(guī)律，在12h 和24h組，其表達(dá)維持較高水平，尤其是Smad3。其表達(dá)規(guī)律基本與其配體TGFβ1、2 一致。同時，Smad2、3 表達(dá)規(guī)律的細(xì)微差異提示我們兩者在這一過程中發(fā)揮作用的機(jī)制及時序可能存在差異。研究顯示，Smad2能夠完成Smad3 在軟骨形成早期的大部分功能，但是Smad3 通過調(diào)節(jié)TGFβ 信號通路抑制軟骨細(xì)胞的終末分化從而維持軟骨的內(nèi)穩(wěn)定。Smad4 作為唯一的通用型Smad 分子，是TGFβ 信號通路的中心介導(dǎo)者。本實驗中，Smad4 在短時張應(yīng)力作用下，具有較穩(wěn)定的表達(dá)，但隨著加力時間增加，其表達(dá)明顯上調(diào)。這一表達(dá)規(guī)律與TGFβ1、2 及Smad2、3 的變化趨勢基本一致。因此我們認(rèn)為，在機(jī)械張應(yīng)力刺激下，TGFβ/Smad 經(jīng)典信號通路參與了機(jī)械應(yīng)力對細(xì)胞的增殖和早期分化的調(diào)控。

Smad7 對TGFβ 介導(dǎo)的細(xì)胞作用具有重要的調(diào)控作用，如細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡和上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變等。在張應(yīng)力作用下，Smad7 加力后3h 即出現(xiàn)了較高的表達(dá)，并隨著加力時間的延長而逐漸下降。I-Smads 能夠受TGFβ 超家族成員比如TGFβ、Nodal 和BMP 等的誘導(dǎo)而表達(dá)，因此形成一個負(fù)反饋的機(jī)制[16，17]。本實驗中，在張應(yīng)力作用下表達(dá)上調(diào)的TGFβ 及Smad2、3 和4可能激活了Smad7 的負(fù)反饋作用，其在應(yīng)力刺激前期的高表達(dá)，可能是成骨細(xì)胞在1h、3h 增殖活性變化不明顯的主要原因之一。隨著加力時間的增加，其表達(dá)下調(diào)，成骨細(xì)胞增殖指數(shù)明顯增大。但在24h組，其表達(dá)較12h 組有所上升，這可能與細(xì)胞進(jìn)入下一個有絲分裂期，其表達(dá)變化受前一階段細(xì)胞分裂的影響有關(guān)。由于Smad7 對于TGFβ 和BMP 均有抑制作用，并且參與了多條信號通路的串話，因此，需要更深入的實驗來闡明整個作用機(jī)制。

本實驗對成骨細(xì)胞在張應(yīng)力作用下，ALP、OCN、Runx2 及COL-I mRNA 的表達(dá)進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)在牽張力作用3h 后，成骨細(xì)胞上述基因表達(dá)均被上調(diào)，這一結(jié)果與以往研究一致。在加力后6h，上述基因的表達(dá)均下降。這可能是由于持續(xù)力作用下，細(xì)胞形變達(dá)到一定程度，對力學(xué)刺激的敏感性降低，而出現(xiàn)了不應(yīng)期。隨著加力時間的延長，上述成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物mRNA 表達(dá)水平再次上升，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組，提示牽張力能誘發(fā)成骨細(xì)胞的分化成熟趨勢，從而影響了細(xì)胞基質(zhì)合成及礦化。