王瑞，姜現(xiàn)壘，董建國，曲哲會，趙瑜，張建錄，劉濤**

（1.信陽農(nóng)林學(xué)院牧醫(yī)工程學(xué)院，河南信陽，464000；2.信陽市平橋區(qū)畜牧工作站河南信陽464100）

豬源大腸桿菌是造成新生仔豬斷奶后仔豬腹瀉的最重要病原，由于大腸桿菌血清型眾多，且抗生素耐藥性問題日益突出，尋找具有抑制大腸桿菌的中藥品種具有十分重要的意義。貓爪草原為無名野草，藥用歷史較短，是上世紀(jì)50 年代于河南省信陽地區(qū)發(fā)現(xiàn)的一種草藥，后經(jīng)信陽中醫(yī)院依據(jù)其根形及能治療鼠瘡的特點(diǎn)定名為“貓爪草”[1]。本文通過紙片法、打洞法、牛津杯法、試管二倍稀釋法，探討貓爪草提取物對豬源大腸桿菌體外抑菌效果。

1 材料

1.1 藥物及試劑

貓爪草購自信陽市淮濱縣中草藥市場；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基購自杭州濱河微生物試劑有限公司；豬源大腸桿菌由河南省信陽農(nóng)林學(xué)院牧醫(yī)工程學(xué)院動物疾病監(jiān)測實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 中藥藥液的提取

將50g 貓爪草放入500mL 水中，浸泡30min 以后再煮沸30min。冷卻后用智能真空泵及布氏漏斗對藥液進(jìn)行過濾，濾液備用。于沉渣中加500mL 水，第二次煮沸30min。冷卻后用智能真空泵及布氏漏斗對藥液進(jìn)行過濾。然后將兩次濾液倒在一起，離心除去沉淀的沉渣，將濾液放至水浴鍋進(jìn)行濃縮至50mL。此時(shí)制得的藥液濃度為1g/mL。

1.3 藥敏片的制備

取定性濾紙，制作成6mm 直徑的圓形紙片，將紙片進(jìn)行高壓滅菌烘干備用。將藥液制備成1g/mL、0.75g/mL、0.5g/mL、0.25g/mL 的濃度，各取1mL 藥液分別浸泡50 片藥敏試紙片1h，將浸泡好的藥敏片烘干。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 菌液的制備

取甘油冷凍保存的大腸桿菌凍存管，放置到40℃恒溫水浴鍋中復(fù)蘇。抽取菌液注入至肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18～24h。保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 細(xì)菌平板計(jì)數(shù)

將大腸桿菌肉湯培養(yǎng)物用涂菌棒涂布到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，37℃培育16 h 后，挑取單個(gè)菌落再次接種到肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后計(jì)數(shù)，將肉湯稀釋至105CFU/mL，置4℃冰箱內(nèi)保存。

2.2 分光光度計(jì)計(jì)數(shù)

將菌液加入含有5mL 營養(yǎng)肉湯的試管中，放入37℃恒溫振蕩箱，分別于2h、3h、4h、5h、6h、7h 每隔一小時(shí)取2mL 培養(yǎng)液經(jīng)分光光度計(jì)測量600nm 細(xì)菌的OD 值，用蒸餾水做對照，繪制細(xì)菌生長曲線，并觀察細(xì)菌生長達(dá)到峰值的時(shí)間。

2.3 體外抑菌實(shí)驗(yàn)

2.3.1 藥敏片法

抽取100μL 菌液注入到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，并用涂菌棒涂布均勻。將藥敏片均勻貼到培養(yǎng)基表面。待干燥后，貼上不同濃度的（1g/mL、0.75g/mL、0.5g/mL、0.25g/mL、對照組）的藥敏片。將培養(yǎng)基置37℃恒溫培養(yǎng)箱中18h，量取抑菌圈直徑。

2.3.2 打孔法

抽取100μL 菌液注入到培養(yǎng)基上并涂布均勻。靜置干燥5min，用打孔器等距打五個(gè)孔，在孔內(nèi)注入不同濃度的藥液（1g/mL、0.75g/mL、0.5g/mL、0.25g/mL、對照組）50μL。將培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)18h 后，量取抑菌圈直徑。

2.3.3 牛津杯法

用滅菌棉簽將稀釋好的濃度為105CFU/mL 的菌液均勻地涂抹于營養(yǎng)瓊脂表面。將五個(gè)滅菌的牛津杯，等距放置在培養(yǎng)基上，牛津杯孔內(nèi)加入不同濃度的藥液（1g/mL、0.75g/mL、0.5g/mL、0.25g/mL、對照組）50μL。將營養(yǎng)瓊脂基置于37℃溫箱中培養(yǎng)18h，分別量取抑菌圈直徑。

2.3.4 最小抑菌濃度測定

準(zhǔn)備10 支試管，在第1 支試管注入1.5mL 藥液和0.5mL 肉湯，調(diào)整藥液濃度為0.75g/mL；其余9 支試管依次注入2mL 營養(yǎng)肉湯，在第2 支試管注入2mL 濃度為1g/mL 藥液，多次混合均勻，再吸取2mL 注入第3 只試管，依次稀釋到第9 只試管，最后棄去2mL；最后再往每一支試管中注入100μL 菌液。同時(shí)設(shè)置對照組，將試管標(biāo)記好放置于37℃恒溫箱培育過夜，觀察結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 抑菌圈

見表1：結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：參考引文[1]。實(shí)驗(yàn)表明，三種不同方法結(jié)果均表明貓爪草提取液在0.75g/mL 和1g/mL 濃度時(shí)，對大腸桿菌表現(xiàn)出抑菌效果。

表 1 不同方法測定的平均抑菌圈大小

圖2 藥敏片法

圖3 打孔法

圖4 牛津杯法

3.2 最低抑菌濃度

見表2：判定標(biāo)準(zhǔn)參考引文[1]。

見圖5 和圖6，標(biāo)記為D-J 試管均有明顯渾濁，取A、B、C 清亮的的混合液，涂布平板，涂A 試管的平板僅長出個(gè)別菌落，B、C 平板長滿菌落，判定0.75g/mL 是最小抑菌濃度，將該平板培育48h，出現(xiàn)大量菌苔。

表 2 二倍稀釋法試管濃度

圖5 不同濃度藥液與菌液混合培養(yǎng)物

圖6 不同濃度混合培養(yǎng)物涂布培養(yǎng)基

3.3 最低殺菌濃度

見表3，判定標(biāo)準(zhǔn)參考引文[1]。

見圖6，原藥液濃度濃縮為2g/mL 后，重復(fù)上述操作，后6 支試管均有明顯渾濁，取a、b、c、d 清亮的混合液，涂布營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。涂a 試管混合液的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基僅生長出個(gè)別菌落，b、c、d 平板長滿菌苔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，涂布a 試管混合液的營養(yǎng)瓊脂平板上仍僅有個(gè)別菌落，判定1g/mL 為MBC。

表 3 二倍稀釋法試管濃

4 討論與結(jié)論

4.1 討論

本試驗(yàn)為水煎法制得中藥提取物，和引文標(biāo)注的醇提法不同[1]。一般醇提法可降低雜質(zhì)部分含量。提取方法與中藥的抑菌效果有一定聯(lián)系。需要進(jìn)一步試驗(yàn)醇提法制備貓爪草提取物，驗(yàn)證其抑制豬源大腸桿菌的效果。目前中藥體外抑菌試驗(yàn)主要有紙片擴(kuò)散法和二倍稀釋法，但是試驗(yàn)過程可能會受到細(xì)菌耐藥性、中藥有效部位的提取方法影響。因此本試驗(yàn)采用藥敏片法、打孔法和牛津杯法三種方法分別測量抑菌圈大小，試驗(yàn)對象統(tǒng)一，盡可能保證試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性。臨床上豬源大腸桿菌分離株較多，此次試驗(yàn)僅對1 株豬源大腸桿菌進(jìn)行了體外抑菌試驗(yàn)，今后還需陸續(xù)對更多的分離株進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。

4.2 結(jié)論

采用水提法獲得的貓爪草提取物對分離的豬源大腸桿菌具有一定的抑菌效果。通過試驗(yàn)結(jié)果可知，貓爪草提取物對該株大腸桿菌的最低抑菌濃度是0.75g/mL，最低殺菌濃度是1g/mL。貓爪草過去主要用于治療肺結(jié)核、淋巴結(jié)炎、咽喉炎、癤病、腫瘤等疾病。通過此次試驗(yàn)，證實(shí)其對豬源大腸桿菌同樣具有抑菌效果，在減抗替抗的養(yǎng)殖業(yè)大背景下，貓爪草具有一定的開發(fā)利用

圖7 最小殺菌濃度的測定