趙婉彤， 潘 芬， 姚劍杰， 秦惠宏， 張 泓

肺炎鏈球菌在引起5歲以下兒童死于肺炎的致病菌中排名第一[1]。近年來隨著抗生素的廣泛應用，細菌耐藥性不斷增高，還相繼出現了多重耐藥菌株，給臨床抗感染治療帶來困難，藥敏試驗在臨床治療中顯得愈發(fā)重要。目前臨床上常用的藥敏測定方法有紙片擴散法、微量肉湯稀釋法、E試驗法和VITEK 2自動化儀器法等。為臨床提供快速、準確、方便的鏈球菌藥敏試驗測定方法，本文以微量肉湯稀釋法為金標準（以下稱標準方法），比較賽默飛（Thermo）藥物敏感性試驗STP6F苛養(yǎng)菌參考卡（以下簡稱Thermo STP6F藥敏卡）測定臨床分離鏈球菌對抗菌藥物的敏感性，現將結果報道如 下。

1 材料與方法

1.1 菌株

收集上海市兒童醫(yī)院臨床送檢標本中的鏈球菌共199株進行本項實驗。經MS鑒定，其中肺炎鏈球菌123株、化膿鏈球菌40株、無乳鏈球菌36株。質控菌株肺炎鏈球菌ATCC 49619，來自上海市臨床檢驗中 心。

1.2 主要試劑與材料

細菌培養(yǎng)用血平皿為上海伊華生物有限公司產品，抗菌藥物粉劑購自大連美侖生物技術有限公司（頭孢噻肟，N0929AS，92.20%；甲氧芐啶，A0709AS，99.80%；磺胺甲唑，M0505AS，99.90%）和中國食品藥品檢定研究院（青霉素，130437，93.10%；頭孢吡肟，130524-201404，84.50%；紅霉素，130307-201417，93.30%；克林霉素，130422-201306，84.90%；左氧氟沙星，130455-201607，97.30%；美羅培南，130506-201403，87.00%；四環(huán)素，130306-201419，969 μg/mg；萬古霉素，130360，1 066 μg/mg）。Thermo STP6F藥敏卡（B6062A）、接種培養(yǎng)基 [CP112-10]（920765）和自動加樣機Sensititre?Autolnoculator?[V3010]由Thermo生物公司提供。

1.3 方法

將菌株復蘇后分區(qū)劃線接種于血平皿，培養(yǎng)后挑取典型單菌落傳代1次，置于35 ℃、5%CO2條件下再次培養(yǎng)20～24 h。采取直接菌落懸液法配制0.5麥氏濁度的菌液備用。

1.3.1 微量肉湯稀釋法 按美國臨床和實驗室標準化協(xié)會（CLSI ）M07-A9[2]的標準操作程序進行，無菌操作將反復凍融的50%裂解的馬血（Laked horse blood，LHB）與雙倍陽離子調節(jié)肉湯（Caton-adjusted Mueller-Hnton Broth，CAMHB）混合，配成5% 凍融裂解馬血培養(yǎng)基，并在15 min內完成藥敏試驗。35 ℃空氣環(huán)境下培養(yǎng)20～24 h，根據CLSI M100-S26[3]提供的折點判讀其敏感性。

1.3.2 Thermo STP6F藥敏卡 按試劑盒說明書操作，將0.5麥氏濁度的細菌懸液接種至11 mL接種培養(yǎng)液中混勻后，根據Sensititre?Autolnoculator?[V3010]使用說明書對藥敏板進行加樣，用黏性密封膜蓋上藥敏板所有微孔，孵育條件及結果判讀同微量肉湯稀釋法。

1.4 統(tǒng)計分析

按ISO 20776-2指南計算以下指標[4]，①基本一致率（essential agreement，EA）：兩種方法得到的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值完全一致或相差在±1個倍比稀釋度之內；②分類一致率（categorical agreement，CA）：指按CLSI折點對兩種藥敏測試方法獲得的MIC值判讀敏感、中介或耐藥結果的一致性；③重大偏差（very major discrepancy，VMD）：標準方法獲得的MIC值為“耐藥”（R）而測試方法獲得的MIC值為“敏感”（S）；④ 較大偏差（major discrepancy，MD）：標準方法獲得的MIC值為S，而測試方法獲得的MIC值為R；⑤ 次要偏差（minor discrepancy，mD）：兩方法中任一個MIC值為“中介”（I），而另一MIC值為S或R。綜合比較所有菌株對測試獲得的所有MIC值的兩種方法結果計算得出總體CA和EA，總VMD、MD和mD以百分數表達。當EA＞90%、CA＞90%、VMD＜1.5%、MD＜3%、mD＜10%時則認為測試方法藥敏結果可接 受。

2 結果

2.1 兩種方法測試肺炎鏈球菌藥敏結果

Thermo STP6F藥敏卡板條測定10種抗菌藥物對74株青霉素敏感肺炎鏈球菌（PSSP）和49株青霉素不敏感肺炎鏈球菌（PNSP）共123株肺炎鏈球菌的MIC值，與標準方法測試結果相比較，總體EA為95.5%，CA為94.6%，VMD、MD及mD分別為0.5%、1.2%和4.6%。除青霉素（以非腦膜炎折點計算）和美羅培南兩種測試方法獲得MIC值的CA分別為89.4%和81.3%外，其余抗菌藥物包括頭孢吡肟、頭孢噻肟、克林霉素、紅霉素、左氧氟沙星、四環(huán)素、甲氧芐啶-磺胺甲唑和萬古霉素等MIC值的CA均大于90%（表1）。青霉素出現13株涉及中介結果mD（10.6%），未發(fā)生VMD和MD。美羅培南結果中有7株細菌的MIC值是差異±2個稀釋度，其中有3株Thermo STP6F藥敏卡將耐藥誤判為敏感（VMD，12.5%），1株將敏感誤判為耐藥（MD，2.0%）（圖1）。除美羅培南外，其余所檢測的抗菌藥物均未出現VMD。

表1 Thermo STP6F對123株肺炎鏈球菌測試結果與微量肉湯稀釋法比較Table 1 Susceptibility of 123 S. pneumoniae strains determined by Thermo STP6F plate and reference method broth microdilution

圖1 Thermo STP6F測試PSSP和PNSP對美羅培南敏感性結果與微量肉湯稀釋法比較Figure 1 Susceptibility testing results of meropenem against 123 strains of Streptococcus pneumoniae compared between broth microdilution （BMD） and Thermo STP6F plate

2.2 兩種方法測試化膿鏈球菌藥敏結果

對于化膿鏈球菌，兩種方法測得的抗菌藥物MIC值的總EA和CA分別為95.0%和99.2% ，VMD及MD皆為0.8%，mD為0。其中頭孢吡肟、頭孢噻肟、克林霉素、紅霉素、美羅培南、青霉素和萬古霉素等抗菌藥物MIC值的EA和CA 均為100%，左氧氟沙星、四環(huán)素的CA和EA分別為97.5%和85.0%、95.0%和75.0%（表2）。CLSI文件中的甲氧芐啶-磺胺甲唑無判讀折點，無法計算CA，其EA 90%。四環(huán)素和左氧氟沙星各有1株MIC結果被Thermo STP6F 錯誤鑒定為耐藥（MD），另外四環(huán)素還有1株MIC結果被錯誤鑒定為敏感（VMD）。

2.3 兩種方法測試無乳鏈球菌藥敏結果

對于無乳鏈球菌，兩者總體CA為97.8%，EA為93.6%，VMD為1.1%，MD為0.9%，mD為1.2%。其中頭孢吡肟、頭孢噻肟、美羅培南、青霉素、四環(huán)素和萬古霉素的CA均為100%?？肆置顾睾妥笱醴承堑腃A均大于90%，紅霉素的EA和CA均為88.9%（表3）。對于CLSI無適用耐藥折點的抗菌藥物，其CA按敏感或非敏感計算。

表2 Thermo STP6F 對40株化膿鏈球菌測試結果與微量肉湯稀釋法比較Table 2 Susceptibility of 40 S. pyogenes strains determined by Thermo STP6F plate and reference method broth microdilution

3 討論

國際上常采用CNAS-CL01等[5-6]提供的方法和標準評估AST新方法或設備。本文比較了Thermo STP6F藥敏卡和微量肉湯稀釋法兩種藥敏試驗方法，測定10種抗菌藥物對臨床分離的199株鏈球菌的MIC值，結果顯示肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌和無乳鏈球菌的兩種測試方法獲得的結果EA和CA較好，但其中肺炎鏈球菌的青霉素和美羅培南CA低于90%，與國外報道的研究結果類似[7-8]。

表3 Thermo STP 6F 對36株無乳鏈球菌測試結果與微量肉湯稀釋法比較Table 3 Susceptibility of 36 S. agalactiae strains determined by Thermo STP6F plate and reference method broth microdilution

本組資料顯示Thermo STP6F藥敏卡測試頭孢噻肟、紅霉素、左氧氟沙星和青霉素的MIC值結果比金標準微量肉湯稀釋法高，與Rennie等[7]、Charles等[8]研究結果一致。VITEK 2因其方便快速等優(yōu)點在國內微生物臨床實驗室中應用廣泛，但熊安英等[9]研究指出VITEK 2-Compact AST-GP68由于檢測原理局限使其對青霉素、美羅培南等藥敏試驗結果易出現假耐藥現象。本組資料顯示Thermo STP6F 藥敏卡的青霉素結果常發(fā)現拖尾或跳孔現象，使終點難以確定，且MIC結果的判讀受人為主觀因素影響較大，一定程度上造成了MIC值的差異。故在實驗操作中特別注意使菌懸液充分乳化，避免細菌懸浮分散不均勻。當用肺炎鏈球菌測試氯霉素、克林霉素、紅霉素、利奈唑胺和四環(huán)素時，判讀時在拖尾生長開始的最低濃度處讀取MIC，微弱生長的小點應忽略不計，培養(yǎng)基中的甲氧芐啶和磺胺類抑制劑可以允許一些輕微的生長，與對照比較讀取終點濃度應與生長對照相比抑制≥80%的生長。本組資料顯示雖然對于肺炎鏈球菌青霉素結果有近63.9%（23/36）的結果高出1個稀釋度，但其MD和VMD均為0。

74株PSSP和49株PNSP的美羅培南EA分別為98.6%和87.8%，123株肺炎鏈球菌美羅培南CA為81.3%。CA較低的主要原因是有19株細菌發(fā)生了mD，其中有15株細菌Thermo STP6F測定的MIC值低于標準方法測定MIC值1個稀釋度，故12株標準方法結果判斷為中介、Thermo STP6F結果為敏感；3株標準方法結果為耐藥、Thermo STP6F結果為中介；此外，2株標準方法結果為中介、Thermo STP6F結果為耐藥，2株標準方法結果為敏感、Thermo STP6F結果為中介。但在化膿鏈球菌和無乳鏈球菌中，美羅培南的EA為100%，可能由于化膿鏈球菌和無乳鏈球菌美羅培南MIC值都很低，從而呈現出的EA和CA均較好。稀釋法易受菌懸液濃度、抗生素拮抗劑含量和鈣鎂離子含量等影響，Rennie等[7]指出肉湯法中使用的微量體積肉湯會降低發(fā)現生長緩慢耐藥亞群的可能性，但這一點還尚不完全清楚 。對于肺炎鏈球菌美羅培南還沒有可靠的紙片擴散法藥敏試驗，檢測其體外抗菌活性最好使用稀釋法確定。當青霉素對于非腦膜炎分離株MIC≤0.06 mg/L（或苯唑西林抑菌圈直徑≥20 mm）時，可預報美羅培南為敏感，當青霉素MIC＞0.06 mg/L時，對美羅培南中介或耐藥的結果用E試驗法復核[10]。

本文根據ISO 20776-2文件[4]中的要求，MD基于標準方法測定得出的敏感菌株數計算，VMD基于標準方法確定為耐藥分離株數目計算，而國內許多研究的偏差基于所有菌株總數計算[9，11-12]，得出的偏差值會明顯偏 低。

本組資料顯示受試的各組鏈球菌屬細菌對各種抗菌藥物的敏感性兩種方法的CA有差異。如青霉素、頭孢噻肟、頭孢吡肟、美羅培南和萬古霉素等對化膿鏈球菌、無乳鏈球菌MIC值都相對較低，兩種方法的CA均達100%。但肺炎鏈球菌對青霉素等上述β內酰胺類就不盡然，兩種方法測試肺炎鏈球菌對青霉素的敏感性，74株PSSP的CA為87.8%；49株PNSP的CA為91.8%；123株肺炎鏈球菌總的CA為89.4%；而123株肺炎鏈球菌對萬古霉素總的CA為100%。提示CA與細菌對抗菌藥物敏感和耐藥性有關。

基于以上研究結果提示，Thermo鏈球菌MIC藥敏板條結果與手工微量肉湯稀釋法一致性較好，操作簡便，假敏感和假耐藥的風險很低，但其抗菌藥物濃度梯度覆蓋面窄，部分藥物結果與微量肉湯稀釋法有差異，臨床微生物室可根據具體的目的和實驗室條件選擇合適的檢驗方法，互為完善，在用于檢測肺炎鏈球菌對美羅培南藥物敏感性必要時建議結合E試驗法復核結 果。