郝 敏， 秦曉華

肺炎克雷伯菌屬于腸桿菌科細(xì)菌，是常見的醫(yī)院獲得性病原菌。近年來，全球碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（carbapenem resistantKlebsiella pneumoniae，CRKP）的出現(xiàn)和廣泛傳播成為一個亟待解決的公共衛(wèi)生問題。我國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)CHINET數(shù)據(jù)顯示肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類的耐藥率逐年攀升，至2017年已上升至23.1%[1]，較2005年耐藥率上升約24倍。導(dǎo)致碳青霉烯類耐藥的原因有多種，但產(chǎn)碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類耐藥的最主要的原因，其中又以KPC型碳青霉烯酶（Klebsiella pneumoniaecarbapenemase） 最為常見[2-3]。blaKPC基因通常位于可移動元件上，通過質(zhì)粒在不同菌株間傳播，耐藥質(zhì)粒上常攜帶多種耐藥基因，使得其幾乎對所有常用抗菌藥物耐藥，為臨床治療CRKP感染患者帶來極大的挑戰(zhàn)。

已有越來越多的文獻(xiàn)報道表明聯(lián)合使用抗菌藥物可能對治療CRKP感染有效。臨床上也通常選用聯(lián)合方案而不是單藥來治療CRKP感染[4-5]。碳青霉烯類抗生素通常不單獨用于治療，但與其他抗菌藥物聯(lián)合使用具有一定的協(xié)同作用。有研究表明，基于碳青霉烯類的聯(lián)合方案治療患者病死率明顯低于不含有碳青霉烯類的聯(lián)合方案，尤其是當(dāng)菌株對碳青霉烯類耐藥程度較低時[6]，較為常見的有碳青霉烯類與多黏菌素類、替加環(huán)素、磷霉素、利福平等聯(lián)合應(yīng)用[7]。但目前對于何種聯(lián)合方案更加有效并沒有一致的結(jié)論，本文應(yīng)用棋盤法聯(lián)合藥敏和體外殺菌曲線方法評估目前常見聯(lián)合應(yīng)用方案以及其他潛在聯(lián)合方案的體外殺菌效 果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院2014－2015年分離的10株非重復(fù)的CRKP，均來自神經(jīng)外科術(shù)后感染患者標(biāo)本。其中9株分離自9例肺部感染患者的痰液標(biāo)本，1株分離自1例中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者的腦脊液標(biāo)本。10株非重復(fù)的肺炎克雷伯菌的美羅培南紙片法抑菌圈直徑均≤19 mm，符合CDC 2015年關(guān)于碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌（CRE）判定的標(biāo)準(zhǔn)[8]，即均為CRKP。進一步對10株CRKP菌株進行16S rRNA擴增復(fù)核鑒定[9]。

1.1.2 培養(yǎng)基和抗菌藥物 藥敏試驗用英國OXOID公司陽離子調(diào)節(jié)Mueller-Hinton肉湯。抗菌藥物紙片為英國OXOID公司商品。抗菌藥物粉劑亞胺培南、美羅培南、厄他培南、黏菌素 、哌拉西林等為大連美倫公司標(biāo)準(zhǔn)品，慶大霉素、阿米卡星、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、甲氧芐啶、磺胺甲唑、替加環(huán)素、氨曲南、他唑巴坦、克拉維酸、利福平為國家衛(wèi)健委食品藥品鑒定研究所標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2 方法

1.2.1 碳青霉烯酶的篩選 PCR法擴增碳青霉烯酶基因（KPC、NDM-1、VIM和IMP）。所用引物見參考文獻(xiàn)[10]，陽性擴增產(chǎn)物送至上海邁浦生物科技有限公司使用3730XL測序儀進行Sanger法DNA測序，測序結(jié)果在NCBI GenBank網(wǎng)站上通過BLAST搜索引擎與標(biāo)準(zhǔn)序列進行比對確認(rèn)以明確基因型別。

1.2.2 微量稀釋法藥敏試驗 采用微量肉湯稀釋法測定14種抗菌藥物對10株CRKP的最低抑菌濃度（MIC）。其中甲氧芐啶-磺胺甲唑和哌拉西林-他唑巴坦為復(fù)合制劑、其余12種包括亞胺培南、美羅培南、厄他培南等在內(nèi)的均為近年來臨床沿用的抗菌藥物。藥敏試驗質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922 。按照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI） 2017年M100s-27th推薦的規(guī)范和折點實施試驗和判讀結(jié)果[11]。其中替加環(huán)素按照歐洲抗微生物藥敏試驗委員會（EUCAST）推薦的規(guī)范和折點實施試驗和判讀結(jié)果。替加環(huán)素對腸桿菌科細(xì)菌的MIC≤2 mg/L為敏感（S）、MIC≥8 mg/L 為耐藥（R）[12]。

1.2.3 聯(lián)合藥敏 聯(lián)合藥敏組合方案為亞胺培南分別聯(lián)合黏菌素、替加環(huán)素、頭孢他啶、利福平、厄他培南、克拉維酸、環(huán)丙沙星、阿米卡星。棋盤法測試濃度范圍為亞胺培南1/8 MIC～8MIC濃度，其余藥物為1/32 MIC～32 MIC濃度。每孔分別加入2種聯(lián)合用藥的抗生素各12.5 μL，再加入以新鮮菌落制備0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊慕臃N菌液，稀釋102倍后菌液濃度為106cfu/mL的菌懸液25 μL，微孔板中的最終接種菌量為5×105cfu/ mL。37 ℃培養(yǎng)16～20 h，讀取結(jié)果并記錄單藥和兩藥聯(lián)合時MIC值[13]。

部分抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration index， FIC）作為聯(lián)合藥敏試驗結(jié)果的判斷依據(jù)。FIC=MIC甲藥聯(lián)合/MIC甲藥單藥+MIC乙藥聯(lián)合/MIC乙藥單藥。FIC≤0.5為協(xié)同作用，0.5＜FIC≤1為相加作用，1＜FIC≤2為無關(guān)作用，F(xiàn)IC＞2為拮抗作用[14]。

1.2.4 時間-殺菌曲線 挑取純分菌落于2 mL肉湯中，35 ℃18 h過夜培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)的菌液調(diào)節(jié)至0.5麥?zhǔn)蠞岫?，再將其稀?02倍，搖床震蕩1.5 h（t+0）h。分別選取聯(lián)合方案FIC值最小時抗菌藥物的濃度作為殺菌曲線藥物濃度，在預(yù)先配置好藥物濃度的肉湯中接種（t+0）h的菌液，使得初始濃度在106cfu/mL左右。37 ℃培養(yǎng)24 h，在（t+0、t+2、t+4、t+6、t+8、t+10、t+24）h 7個時間點取10 μL菌液進行適當(dāng)稀釋涂布平皿，進行菌落計數(shù)[13]。

2 結(jié)果

2.1 CRKP藥敏試驗的結(jié)果

10株CRKP對黏菌素的敏感率為100%，對替加環(huán)素的敏感率為80%；而對美羅培南、亞胺培南、厄他培南、慶大霉素、頭孢噻肟、頭孢吡肟、氨曲南、哌拉西林-他唑巴坦的耐藥率都達(dá)到100%；對阿米卡星、頭孢他啶、環(huán)丙沙星和甲氧吡啶-磺胺甲唑的耐藥率分別為80%、90%、80%和70%。

2.2 碳青霉烯酶的檢測

10株CRKP經(jīng)PCR擴增，blaKPC-2基因均為陽性，后擴增產(chǎn)物經(jīng)DNA測序，與NCBI網(wǎng)站GenBank數(shù)據(jù)庫比對后明確均為blaKPC-2碳青霉烯酶基因，其他碳青霉烯酶基因均未檢出。

2.3 亞胺培南與黏菌素等聯(lián)合藥敏

棋盤法藥敏結(jié)果顯示，亞胺培南與黏菌素等8種抗菌藥物對10株CRKP的體外聯(lián)合抑菌試驗顯示均未發(fā)現(xiàn)有拮抗現(xiàn)象。但相比較而言，亞胺培南與厄他培南或與克拉維酸的聯(lián)合抑菌效果最為顯著，其與克拉維酸的聯(lián)合對7株CRKP顯示協(xié)同作用，對3株CRKP顯示相加作用；其與厄他培南聯(lián)合也有6株CRKP顯示協(xié)同作用，另4株菌株顯示無關(guān)作用。亞胺培南與頭孢他啶或與利福平的聯(lián)合，均有2株對CRKP顯示有協(xié)同作用；其中與頭孢他啶的聯(lián)合對另8株CRKP具相加作用；而與利福平的聯(lián)合顯示對6株CRKP呈相加作用，2株呈無關(guān)作用。亞胺培南與黏菌素或與替加環(huán)素的聯(lián)合雖未發(fā)現(xiàn)有拮抗現(xiàn)象，但亦無協(xié)同作用發(fā)生，兩組聯(lián)合均對其中的4株CRKP呈現(xiàn)相加作用，6株無關(guān)。亞胺培南與環(huán)丙沙星或與阿米卡星的兩組聯(lián)合，每組均僅有1株CRKP顯示協(xié)同作用和1株為相加作用，另8株無關(guān)。見表1和表2。

表1 亞胺培南聯(lián)合8種抗菌藥物對10株產(chǎn)KPC-2酶肺炎克雷伯菌的藥敏結(jié)果Table 1 Antimicrobial effect of imipenem in combination with another antibiotic against 10 strains of KPC-2 producing carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae

2.4 亞胺培南與黏菌素等聯(lián)合殺菌曲線

基于棋盤法體外聯(lián)合抑菌試驗的結(jié)果，菌株KPN2和KPN3對最多的聯(lián)合方案表現(xiàn)出協(xié)同作用，因此選擇菌株KPN2和KPN3進一步進行聯(lián)合殺菌試驗，了解亞胺培南和黏菌素等抗菌藥物的聯(lián)合殺菌效果。聯(lián)合殺菌濃度選取亞胺培南與各抗菌藥物的棋盤法藥敏試驗時，顯示FIC值最小點的抗菌藥物MIC值作為聯(lián)合殺菌曲線試驗中的藥物濃度。結(jié)果顯示，亞胺培南聯(lián)合克拉維酸對受試菌KPN2的殺菌曲線顯示亞胺培南在1/4 MIC與1/8 MIC的濃度，KPN3在亞胺培南1/4 MIC和1/16 MIC的濃度時分別在（t+2）h可達(dá)到99.9%或以上的殺菌率，此作用可維持至（t+6）h或（t+8）h；至（t+10）h，亞胺培南聯(lián)合克拉維酸對兩菌的殺菌率逐漸降低，細(xì)菌生長曲線有恢復(fù)上升的趨勢。亞胺培南聯(lián)合利福平對KPN2或聯(lián)合頭孢他啶對KPN3的殺菌曲線同樣可顯示90%或以上的殺菌率，此作用從（t+4）h開始可

維持至（t+10）h。上述所有的聯(lián)合殺菌試驗在培養(yǎng)至24 h后均出現(xiàn)了生長。而受試菌所有單藥的生長曲線與無藥的對照生長曲線同樣呈平行上升趨勢。見圖1。

表2 亞胺培南聯(lián)合克拉維酸、厄他培南對10株產(chǎn)KPC-2酶肺炎克雷伯菌的最小FIC值及結(jié)果Table 2 Minimum FIC values and the corresponding implication of imipenem in combination with clavulanic acid or ertapenem against 10 strains of KPC-2 producing carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae

圖1 體外殺菌曲線Figure 1 in vitro time-kill assay

3 討論

本研究10株CRKP菌株，均來自于神經(jīng)外科術(shù)后患者：9株來自于肺部感染患者痰標(biāo)本，1株來自于中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者腦脊液標(biāo)本。中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者在得到腦脊液培養(yǎng)CRKP結(jié)果后，一度用大劑量亞胺培南-西司他?。?.0 g-1.0 g靜脈滴注，1次/8h）聯(lián)合頭孢他啶（2.0 g靜脈滴注，1 次/8 h）抗感染治療1周，腦脊液白細(xì)胞數(shù)呈下降趨勢，但其后再次出現(xiàn)膿性腦脊液，并出現(xiàn)癲癇發(fā)作，改為美羅培南聯(lián)合多黏菌素B抗感染治療，腦脊液白細(xì)胞數(shù)指標(biāo)再次好轉(zhuǎn)，然而最終因原發(fā)病加重和多臟器功能衰竭死亡。9例肺部感染患者中7例曾在病程中使用大劑量美羅培南（2.0 g，1次/8h）+替加環(huán)素（50 mg，1次/12 h），其中2例臨床好轉(zhuǎn)，3例死亡，2例轉(zhuǎn)歸不明。另2例肺部感染患者，在臨床得到痰培養(yǎng)CRKP結(jié)果前自動出院，轉(zhuǎn)歸不明。由此可見，CRKP所致的醫(yī)院感染，預(yù)后不佳，病死率高。臨床上CRKP感染的治療是非常嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

由于推薦用于治療CRKP感染的藥物十分有限，且價格昂貴[15]，針對治療攜帶blaKPC-2的CRKP感染的頭孢他啶-阿維巴坦尚未在我國上市，目前許多研究都在嘗試尋找臨床治療CRKP感染的有效聯(lián)合方案[16]。本研究的結(jié)果，部分與前期報道的結(jié)果不一致，部分研究表明亞胺培南與替加環(huán)素或多黏菌素E有較好協(xié)同作用[14]，本研究中，亞胺培南與黏菌素或與替加環(huán)素的聯(lián)合方案在棋盤法藥敏中并未顯示出協(xié)同作用。但另有研究者在體外聯(lián)合藥敏試驗中得出了與本試驗相似的結(jié)果[17]，在體外試驗中未發(fā)現(xiàn)亞胺培南與替加環(huán)素或與黏菌素的協(xié)同作用。這是否可能由于體內(nèi)外藥物分布與個體代謝的差異所導(dǎo)致，值得進一步研究。

由于利福平擁有可以滲透進細(xì)胞內(nèi)和生物膜中的特性，本課題將其納入聯(lián)合方案中[18]。曾有報道黏菌素和利福平的聯(lián)合使用對包含CRKP在內(nèi)的多重耐藥病原菌有協(xié)同作用[19]。本研究中亞胺培南和利福平的聯(lián)合方案對部分菌株表現(xiàn)出協(xié)同作用。但以利福平聯(lián)合治療CRKP的方案在臨床并不常用，療效尚無法評估。值得注意的是，利福平會引起某些藥物，如華法林、抗真菌藥物等體內(nèi)代謝水平的改變，所以臨床上選擇利福平聯(lián)合方案需謹(jǐn)慎。

頭孢他啶為半合成的第三代頭孢菌素，對抗革蘭陽性菌和陰性菌具有廣譜抗菌作用，該抗菌藥物適用于敏感革蘭陰性桿菌所致的敗血癥、下呼吸道感染、腹腔膽系感染、復(fù)雜性尿路感染和嚴(yán)重皮膚及皮膚結(jié)構(gòu)感染等。有研究表明頭孢他啶與其他抗菌藥物聯(lián)合使用時，可有協(xié)同作用[20]。也有報道頭孢他啶聯(lián)合左氧氟沙星成功治療產(chǎn)KPC酶的腸桿菌科細(xì)菌感染的案例[21]。本組資料顯示亞胺培南與頭孢他啶的聯(lián)合對20%菌株有協(xié)同作用，并通過體外時間-殺菌曲線得到驗證。表2中KPN3菌株來自于中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者腦脊液標(biāo)本，臨床資料顯示該患者病程中曾采用該聯(lián)合方案治療，一度患者臨床表現(xiàn)好轉(zhuǎn)和腦脊液白細(xì)胞數(shù)下降至正常范圍，但后期感染加重，故該方案的臨床有效性尚需要進一步的研究證實。

有文獻(xiàn)報道，碳青霉烯類抗生素中厄他培南對細(xì)菌產(chǎn)生的KPC酶最不穩(wěn)定，極易為KPC酶水解。這可能是由于厄他培南與KPC酶之間存在較高的的親和性[22]。正是由于這一特性，近年來厄他培南聯(lián)合另一碳青霉烯類藥物的方案（“雙碳”方案）治療產(chǎn)KPC酶CRKP感染的報道多見[23-24]。厄他培南以其盡可能多的結(jié)合KPC酶，使得另一碳青霉烯類藥物可以發(fā)揮抗菌作用。本研究中，棋盤法體外抑菌試驗結(jié)果顯示了厄他培南和亞胺培南的聯(lián)合具有良好的協(xié)同作用，但這一作用并沒有在體外聯(lián)合殺菌曲線中得到驗證，這可能是由于樣本量較小所導(dǎo)致。厄他培南和美羅培南聯(lián)合治療CRKP感染的療效仍需進一步行體內(nèi)外大樣本量的研究。另外，需要指出的是厄他培南與亞胺培南同為碳青霉烯類藥物，體外抑菌試驗結(jié)果中的“協(xié)同”作用實為厄他培南發(fā)揮抑制KPC酶的作用，這與傳統(tǒng)意義上的兩類作用機制不同的抗菌藥物聯(lián)合使用時存在協(xié)同作用，即達(dá)到（1+1）＞2的效果，存在一定差異，即并非真正的協(xié)同作用。

克拉維酸作為一種“自殺性”細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的β內(nèi)酰胺酶抑制劑對大部分β內(nèi)酰胺酶有良好的抑制效果。有少量證據(jù)表明，克拉維酸對KPC酶有抑制效果。有研究表明，以頭孢他啶和克拉維酸作為聯(lián)合方案，可以有效治療產(chǎn)KPC酶的CRKP感染[20]。本研究中，亞胺培南和克拉維酸的聯(lián)合棋盤法體外抑菌試驗結(jié)果和殺菌曲線均顯示該類聯(lián)合對CRKP表現(xiàn)出了良好的協(xié)同抑菌和殺菌作用。提示亞胺培南聯(lián)合克拉維酸可以作為臨床治療CRKP感染的可選藥物之一。需要說明的是，克拉維酸為β內(nèi)酰胺酶抑制劑，該藥本身無抗菌活性，且在亞胺培南和克拉維酸的聯(lián)合方案中，同樣依靠克拉維酸對KPC酶的部分抑制作用而部分恢復(fù)亞胺培南對CRKP菌株的敏感性，有別于傳統(tǒng)意義上的兩種抗菌藥物的協(xié)同作用。

本組資料雖顯示所有的聯(lián)合殺菌試驗在細(xì)菌培養(yǎng)至24 h后均出現(xiàn)了生長，但這不代表具有臨床相關(guān)性，因為在體外進行殺菌曲線試驗時，抗菌藥物為一次性給藥，在實驗中無法像臨床治療患者一樣定時分次補充藥物，以維持穩(wěn)定的藥物濃度。 盡管體外實驗不能完全說明臨床使用的效果，但本研究結(jié)果提示，亞胺培南聯(lián)合頭孢他啶、利福平或克拉維酸，可能為臨床治療CRKP引起的感染提供參考。