王月姣 阮祥燕，2* 谷牧青 蔡桂舉 李 雪 張凌燕 Alfred O.Mueck，2

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100026;2.德國圖賓根大學婦產(chǎn)醫(yī)院婦女健康部與婦女健康研究中心，圖賓根 D-72076，德國)

乳腺癌是中國女性發(fā)病率第一的癌癥，由于乳腺鉬靶的檢查和他莫昔芬的使用，乳腺癌的病死率有所下降(位居第五)，但仍是當今社會最重要的影響女性健康的問題之一[1]。他莫昔芬(tamoxifen, TAM)即三苯氧胺，為非甾體類抗雌激素藥物，在體內(nèi)競爭性結(jié)合雌激素受體(estrogen receptor, ER)，具有抗雌激素及弱雌激素效果[2]。因此他莫昔芬是激素依賴性轉(zhuǎn)移乳腺癌的首選治療藥物，也是ER(+)的原發(fā)乳腺癌的輔助治療藥物[3]。TAM自1960年開始應(yīng)用于治療晚期乳腺癌，1985年開始作為輔助治療廣泛應(yīng)用于各期乳腺癌的治療，幾十年來他莫昔芬一直在乳腺癌內(nèi)分泌治療中占據(jù)首要地位[4]。癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)研究[5]中指出：乳腺癌患者應(yīng)用他莫昔芬治療5年和10年后，出現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌的風險增高，發(fā)生率分別為1.6%及3.1%。臨床中有研究者[6]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)他莫昔芬治療后，陰道超聲可見內(nèi)膜基質(zhì)增生及上皮萎縮，產(chǎn)生與增生型內(nèi)膜、萎縮型內(nèi)膜、息肉相似的超聲影像學，但具體病理改變尚不清楚。

本研究的目的是觀察乳腺癌異種移植瘤經(jīng)他莫昔芬治療后子宮的病理改變及孕激素治療是否會影響乳腺癌的增生及他莫昔芬的治療效果。

1 材料與方法

1.1 細胞系培養(yǎng)

MCF7細胞系是人類雌激素受體陽性的原發(fā)性乳腺癌細胞系，從美國標準培養(yǎng)庫(American Type Culture Collection，ATCC)購買 MCF7 乳腺癌細胞系, 將細胞培養(yǎng)于含10%(體積分數(shù))熱滅活胎牛血清(fetal bovine serum， FBS)、25 mmol/L HEPES以及1%(質(zhì)量分數(shù))青霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)液中。37 ℃，5%(體積分數(shù))CO2條件下細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.2 實驗動物

25只6～7周齡的BALB/c雌性裸鼠由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，裸鼠質(zhì)量18～20 g，動物生產(chǎn)合格證號：SCXK(京)2016-0006，飼養(yǎng)于SPF級動物室。因為裸鼠MCF7異種移植瘤細胞生長需要雌激素的存在，所以雌二醇(estradiol，E2)緩釋片在腫瘤細胞注射前48 h植入(可誘導E2濃度為1 000 pg/mL，與絕經(jīng)期激素治療產(chǎn)生的約100pg/mL為生物等效劑量)。將各裸鼠皮下注射上述細胞懸液 100 μL/site，注射細胞數(shù)為1×107。細胞注射當天記為接種第0天。

1.3 分組及給藥

用電子卡尺每周兩次測量每個腫瘤的長度和寬度，計算腫瘤體積，計算公式為：體積=1/2×長度×寬度2。43 d后，測量每只裸鼠的腫瘤體積，將25只裸鼠按照腫瘤大小采用數(shù)字表法隨機分為4個亞組：安慰劑組、黃體酮(progesterone, P)組、他莫昔芬組及黃體酮+他莫昔芬組，每組6只裸鼠(剩余1只裸鼠實施安樂死)。隨機分組時亦考慮各組裸鼠體質(zhì)量，分別使各組間裸鼠平均體質(zhì)量處于同一水平。安慰劑組：予以0.1 mL的玉米油腹腔注射；P組：黃體酮片(10 mg/片，60 d緩釋)皮下包埋；TAM組：電子天平稱量他莫昔芬粉末(Tamoxifen，Sigma公司，美國)100 mg，加入到20 mL預溫到42 ℃的玉米油(Corn Oil, Sigma公司，美國)，震蕩后充分溶解，得到5 mg/mL他莫昔芬溶液，以鋁箔紙包裹，4 ℃保存，用前恢復至室溫。對裸鼠進行5 mg/mL 他莫昔芬0.1 mL腹腔注射，連續(xù)注射3 d，停一天。P+TAM組、進行黃體酮皮下包埋，他莫昔芬腹腔注射劑量同TAM組。每周兩次測量裸鼠體質(zhì)量及腫瘤體積，治療結(jié)束時(56 d)，處死裸鼠取腫瘤、子宮。新鮮的組織立即置于4%(質(zhì)量分數(shù))多聚甲醛中保存，進行HE染色及腫瘤生長曲線的繪制。

1.5 蘇木精-伊紅染色及腺體計數(shù)

子宮組織用4%(質(zhì)量分數(shù))多聚甲醛固定過夜，制作石蠟切片，石蠟切片脫蠟至水后，進行蘇木精伊紅(hematoxylin and eosin, HE)染色，顯微鏡鏡檢，圖像分析采集。每張切片隨機選取6個視野(80×)，統(tǒng)計其腺體數(shù)量，取平均值。

1.6 統(tǒng)計學方法

用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學分析。計量數(shù)據(jù)計算均數(shù)、標準差，各組腫瘤生長速度比較采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析；各組腺體個數(shù)比較采用單因素的方差分析，兩兩比較采用LSD法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠腫瘤生長曲線

治療第56天，與安慰劑組相比，黃體酮組均未促進腫瘤的額外增生(P=0.424，P=0.686)，與初始值相比，安慰劑組(于第25天，1只裸鼠死亡)與黃體酮組(于第15及31天，各有1只裸鼠死亡)腫瘤體積分別增加了334.14%、331.14%；他莫昔芬治療后，與安慰劑組相比，腫瘤生長速度呈下降趨勢，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。他莫昔芬聯(lián)合黃體酮組與單獨他莫昔芬處理組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，腫瘤體積較初始值分別降低了59.31%、59.51%(圖1)。

2.2 HE染色結(jié)果

與安慰劑組相比，他莫昔芬治療后的裸鼠異種移植瘤HE染色可見：腫瘤組織較疏松，腫瘤細胞數(shù)量明顯減少，可見壞死的腫瘤細胞和中性粒細胞及淋巴細胞浸潤(圖2)。

圖1 MCF7異種移植瘤腫瘤生長Fig.1 Tumor growth curve of MCF7 xenografts in nude mice

A：tumor growth curve；B: representative images of the tumors after treatment at day 56. E2+Placebo groupvsTamoxifen group*P<0.05;**P<0.01;E2:estradiol.

與安慰劑組相比，他莫昔芬處理后的子宮內(nèi)膜HE染色可見：腺體數(shù)量增多，出現(xiàn)背靠背現(xiàn)象；腺上皮細胞層次增多，排列紊亂，腺體細胞核大，且深染，形狀不一；腺上皮個別細胞可見異型性(圖3)，所有經(jīng)他莫昔芬及他莫昔芬聯(lián)合黃體酮處理后的裸鼠子宮HE染色均出現(xiàn)上述改變。

2.3 腺體計數(shù)

與安慰劑組相比，單用黃體酮并未促進子宮腺體增加，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；經(jīng)過他莫昔芬治療后的異種移植瘤裸鼠子宮內(nèi)膜腺體明顯數(shù)量增加，且差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；他莫昔芬處理組與他莫昔芬聯(lián)合黃體酮處理組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.10)(表1、圖4)。

3 討論

1998年，由牛津大學組織的一項發(fā)表于《柳葉刀》雜志的研究[7]提出，他莫昔芬在預防和治療乳腺癌中都起到了極大的作用，應(yīng)用他莫昔芬治療5年后，乳腺癌的復發(fā)率明顯降低，能提高患者10年生存率，因此廣泛應(yīng)用于乳腺癌的治療。他莫昔芬作為雌激素類似物，既有弱雌激素效應(yīng)，也有抗雌激素效應(yīng)，在乳腺組織中發(fā)揮抗雌激素及抗增生作用，一般用于乳腺癌治療[8]；同時由于他莫昔芬在子宮中發(fā)揮類雌激素作用，長期作用于子宮可導致子宮內(nèi)膜增厚[2]。因此臨床上出現(xiàn)他莫昔芬治療后的女性子宮內(nèi)膜間質(zhì)增生、水腫，超聲下可見子宮內(nèi)膜增厚、不均的影像[6]。本研究模擬乳腺癌患者經(jīng)他莫昔芬治療后的異種移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)他莫昔芬與他莫昔芬及黃體酮處理后的子宮腺體明顯增加，子宮內(nèi)膜出現(xiàn)不典型增生病理改變。因孕激素具有拮抗雌激素的作用，可保護子宮內(nèi)膜，但本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用天然孕激素黃體酮未改變他莫昔芬對子宮內(nèi)膜的增生作用。雖然他莫昔芬對乳腺癌的治療效果良好，但臨床用藥也應(yīng)警惕子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的風險。

圖2 不同組的MCF7裸鼠移植瘤HE染色Fig.2 HE staining of MCF7 xenografts in nude mice

A：E2+Placebo;B:E2+Progesterone;C：E2+Tamoxifen;D：E2+Progesterone+Tamoxifen；Scalebars： 100μm;HE: hematoxylin and eosin;E2:estradiol.

圖3 不同處理移植瘤裸鼠子宮內(nèi)膜HE染色Fig.3 HE staining of endometrium in nude mice in different groups

A：E2+Placebo;B:E2+Progesterone;C：E2+Tamoxifen;D：E2+Progesterone+Tamoxifen.Scalebars: 100μm;HE: hematoxylin and eosin;E2:estradiol.

表1 不同治療組MCF7異種移植瘤裸鼠子宮腺體數(shù)量比較Tab.1 Univariate ANOVA analysis of the number of uterine gland from MCF7 xenografts in nude mice

圖4 不同組的裸鼠子宮腺體個數(shù)Fig.4 The number of uterine glands in nude mice

A：E2+Placebo;B:E2+Progesterone;C：E2+Tamoxifen;D：E2+Progesterone+Tamoxifen,*P<0.05,**P<0.01;E2:estradiol.

隨著女性對更年期的認識不斷提高，越來越多的圍絕經(jīng)期女性開始進行激素替代治療絕經(jīng)相關(guān)癥狀如更年期綜合征、骨質(zhì)疏松、心腦血管疾病等[9-10]，但乳腺癌風險一直是圍絕經(jīng)期女性激素替代治療所擔憂的重要問題之一。激素治療中主要的安全問題就是乳腺癌患病風險，絕經(jīng)后激素治療與乳腺癌的風險爭論一直是絕經(jīng)后女性及婦科內(nèi)分泌領(lǐng)域的熱點及難點[11-12]。本課題組之前的多項研究[13-14]顯示：天然孕酮如黃體酮并未增加乳腺癌組織的增生作用，與筆者本次研究的結(jié)果一致。2015年發(fā)表于Nature的一篇文章[15]顯示：孕激素與他莫昔芬都可以單獨對抗雌激素誘導腫瘤的形成，但是他莫昔芬聯(lián)合孕激素的作用最大。而本研究得出的結(jié)論顯示，黃體酮并未促進乳腺癌的額外增生，兩者的實驗結(jié)果的差別可能由于裸鼠的樣本量及個體差異造成實驗結(jié)論不同，但兩項實驗都證實了黃體酮未促進腫瘤的額外增生，同時孕激素治療后對裸鼠子宮內(nèi)膜未產(chǎn)生病理改變。對臨床絕經(jīng)女性的激素治療提供了理論依據(jù)。但他莫昔芬治療后子宮內(nèi)膜不典型增生、子宮腺體增生活躍的具體機制仍不清楚，需要進一步的探討研究。

結(jié)論：在異種移植瘤裸鼠模型中，他莫昔芬治療后的異種移植瘤體積明顯縮小，治療效果明顯。但他莫昔芬的應(yīng)用導致裸鼠子宮腺體增加，呈不典型增生的病理改變，提示子宮內(nèi)膜癌的風險可能增加。應(yīng)用黃體酮并未促進乳腺癌細胞的明顯增生，子宮腺體增生不明顯，黃體酮未改變他莫昔芬導致的子宮內(nèi)膜不典型增生。但本研究的樣本量不足，無法統(tǒng)計子宮內(nèi)膜不典型增生轉(zhuǎn)變?yōu)樽訉m內(nèi)膜癌的比例，仍需進一步擴大樣本量論證。