汪新龍 劉朝暉 丁巍 梁志科

（廣東省廣州市第一人民醫(yī)院急診科 廣州510180）

慢性阻塞性肺疾?。–hronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD）是以持續(xù)氣流受限為特征的氣道慢性異常炎癥反應(yīng)性疾病[1]?？梢鸱瓮飧髌鞴俳M織損害，在COPD的自然病程中，多種炎癥因子參與其中[2]。白介素10（Interleukin10,IL-10）為具有抑制炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)中起重要作用[3]。腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）為一種多功能細(xì)胞因子，具有廣泛生物活性，是機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，也是目前反應(yīng)機(jī)體炎癥及組織損傷的敏感指標(biāo)。干擾素-γ（INF-γ）為T(mén)h-1細(xì)胞分泌的一種特征性細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞、單核細(xì)胞產(chǎn)生白介素等炎癥因子，破壞生理防御及免疫監(jiān)測(cè)平衡，繼而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。本研究旨在分析慢性阻塞性肺疾病大鼠血清和肺組織中IL-10、TNF-α、INF-γ檢測(cè)意義及與氣道阻力的相關(guān)性?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 模型建立 選取自廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買(mǎi)雄性大鼠45只，周齡均為8周，平均體質(zhì)量為（221.95±6.45）g。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組30只，對(duì)照組15只。模型建立于試驗(yàn)第1天及第15天，兩組均予以10%水合氯醛（國(guó)藥準(zhǔn)字H37022673）4 ml腹腔注射，模型組緩慢向氣道內(nèi)注射脂多糖 （LPS，美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)，貨號(hào)：L2880）0.2 ml，每日 10:00和 15:00予以煙熏 30 min，持續(xù)4周；對(duì)照組緩慢注射生理鹽水0.2 ml，然后放入飼養(yǎng)籠，正常進(jìn)食和進(jìn)水，不予以煙熏處理。

1.2 大鼠肺功能及炎癥因子等指標(biāo)的檢測(cè) 氣道阻力及肺順應(yīng)性檢測(cè)采用美國(guó)Buxco公司生產(chǎn)的Buxco動(dòng)物肺功能RC系統(tǒng)，尾尖取靜脈血0.5 ml留置真空抗凝管，4℃低溫離心10 min，3 500 r/min，取上清液用于檢測(cè)。兩組大鼠肺組織放入10%福爾馬林溶液中浸泡24 h，然后沿右肺門(mén)橫斷進(jìn)行病理組織取材，采用石蠟包埋，二甲苯對(duì)組織標(biāo)本進(jìn)行脫蠟處理后先后采用乙醇和水進(jìn)行沖洗，沖洗完成后蘇木精染色處理，1%鹽酸-乙醇分化液處理，然后伊紅染色，常規(guī)脫水，中性樹(shù)膠凝封，加PBS溶液，充分勻漿后制成勻漿液，充分離心后取上層清液。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）檢測(cè)IL-10、TNF-α及INF-γ水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用率表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行相關(guān)性，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀(guān)察兩組肺組織形態(tài)學(xué) （1）COPD模型組：肺組織顏色蒼白，體積增大，彈性差；肺組織表面無(wú)滲血情況，被膜下存在極個(gè)別出血點(diǎn)。鏡下觀(guān)察可見(jiàn)細(xì)支氣管管壁增厚，呼吸性支氣管狹窄或閉塞；纖毛倒伏，部分脫落；支氣管黏膜細(xì)胞變性、壞死、增生，黏膜下炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞為主，部分為中性粒細(xì)胞；肺泡壁變薄，肺泡腔增大、破裂，或融合成肺大皰。見(jiàn)圖1-A。（2）對(duì)照組：肺組織表面光滑，質(zhì)軟、色澤紅潤(rùn)，彈性較好，未見(jiàn)滲血，且被膜下無(wú)出血。鏡下觀(guān)察未見(jiàn)模型組大鼠類(lèi)似變化。見(jiàn)圖1-B。

圖1 大鼠肺組織病理變化（HE×100）

2.2 兩組大鼠肺功能及血?dú)庵笜?biāo)觀(guān)察比較 （1）肺功能指標(biāo)：模型組大鼠較對(duì)照組大鼠氣道阻力明顯升高，而肺順應(yīng)性較對(duì)照組大鼠顯著降低，P＜0.01。（2）動(dòng)脈血?dú)庵笜?biāo)：模型組大鼠pH值、PaO2水平顯著低于對(duì)照組，PaCO2水平明顯高于對(duì)照組，P＜0.01。見(jiàn)表1。

表1 兩組大鼠肺功能及動(dòng)脈血?dú)庵笜?biāo)比較（±s）

表1 兩組大鼠肺功能及動(dòng)脈血?dú)庵笜?biāo)比較（±s）

動(dòng)脈血?dú)庵笜?biāo)p H P a O 2 P a C O 2（m m H g） （m m H g）模型組對(duì)照組組別 n肺功能指標(biāo)氣道阻力 肺順應(yīng)性[k p a/（m l·s）] （m l/c m H 2 O）3 0 1 5 t P 0.4 8 9±0.0 7 2 0.2 9 5±0.0 4 7 9.4 4 8＜0.0 1 0.3 6 2±0.0 6 1 0.5 2 8±0.0 5 6 8.8 3 5＜0.0 1 7.1 1±0.1 1 7.3 5±0.2 5 4.4 9 5＜0.0 1 6 8.8 4±1 0.1 5 9 5.6 2±7.6 9 8.9 9 0＜0.0 1 6 1.2 5±9.2 6 4 6.6 5±6.0 4 5.5 2 9＜0.0 1

2.3 兩組血清、肺組織炎癥因子水平比較 模型組血清、肺組織中IL-10水平較對(duì)照組明顯降低，TNF-α和INF-γ水平顯著升高，P＜0.01。見(jiàn)表2。

表2 兩組血清、肺組織炎癥因子表達(dá)比較（ng/L，±s）

表2 兩組血清、肺組織炎癥因子表達(dá)比較（ng/L，±s）

I N F-γ血清 肺組織模型組對(duì)照組組別 n I L-1 0血清 肺組織T N F-α血清 肺組織3 0 1 5 t P 4 4.6 9±8.6 7 7 5.9 5±1 0.5 9 1 0.5 8 5＜0.0 1 6 4.5 9±9.0 6 9 4.0 5±8.9 4 1 0.3 2 7＜0.0 1 7 1.9 1±6.4 5 4 5.5 6±5.6 2 1 3.4 1 1＜0.0 1 1 2 4.1 5±1 5.3 2 7 1.4 2±6.9 5 1 2.6 4 1＜0.0 1 9 0 7.1 5±1 4 2.6 2 6 4 5.2 5±2 8.4 5 9.7 8 2＜0.0 1 9 8 3.2 3±1 5 3.6 2 6 7 0.0 5±1 2 5.4 5 7.3 2 2＜0.0 1

2.4 COPD大鼠IL-10、TNF-α和INF-γ水平與肺功能指標(biāo)相關(guān)性分析 COPD大鼠血清IL-10水平與氣道阻力呈負(fù)相關(guān)，r=-0.715，P＜0.01。見(jiàn)圖2。肺組織IL-10水平與氣道阻力呈負(fù)相關(guān)，r=-0.792，P＜0.01。見(jiàn)圖3。血清TNF-α水平與氣道阻力呈正相關(guān)，r=0.752，P＜0.01。見(jiàn)圖 4。肺組織 TNF-α 水平與氣道阻力呈正相關(guān)，r=0.749，P＜0.01。見(jiàn)圖5。血清INF-γ水平與氣道阻力呈正相關(guān)，r=0.801，P＜0.01。見(jiàn)圖6。肺組織INF-γ水平與氣道阻力呈正相關(guān)，r=0.835，P＜0.01。見(jiàn)圖 7。

圖2 COPD大鼠血清IL-10水平與氣道阻力相關(guān)性分析

圖3 COPD大鼠肺組織IL-10水平與氣道阻力相關(guān)性分析

圖4 COPD大鼠血清TNF-α水平與氣道阻力相關(guān)性分析

圖5 COPD大鼠肺組織TNF-α水平與氣道阻力相關(guān)性分析

圖6 COPD大鼠血清INF-γ水平與氣道阻力相關(guān)性分析

圖7 COPD大鼠肺組織INF-γ水平與氣道阻力相關(guān)性分析

3 討論

COPD是呼吸系統(tǒng)常見(jiàn)疾病，主要特征是慢性氣流受阻，且呈進(jìn)行性進(jìn)展。目前有關(guān)本病發(fā)病機(jī)制尚未確切，初步認(rèn)為是氣道受阻、肺實(shí)質(zhì)及肺血管慢性炎癥性損傷導(dǎo)致氣道及血管壁重塑是本病基本病理特征[4]。近年來(lái)，大量研究[5]證實(shí)嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等細(xì)胞因子參與本病發(fā)病過(guò)程中。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)向大鼠氣管內(nèi)注射脂多糖，并反復(fù)香薰的方式建模，比傳統(tǒng)吸入SO2安全性高，比單純熏香煙需要的時(shí)間更短，研究符合COPD病情變化發(fā)展過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大鼠肺組織觀(guān)察證實(shí)，COPD模型大鼠具備和人類(lèi)COPD患者類(lèi)似的氣道非特異性炎癥及阻塞性通氣障礙，且結(jié)合生化實(shí)驗(yàn)確定COPD大鼠模型建立成功。

TNF-α是多功能細(xì)胞因子，具有激活炎癥細(xì)胞以及增加毒性作用，同時(shí)還能釋放其他炎癥細(xì)胞趨化因子，引起氣道高反應(yīng)性[6]。且TNF-α?xí)又匮装Y反應(yīng)，引起呼吸道細(xì)胞分裂增殖，促使氣道結(jié)構(gòu)重塑及肺組織纖維化[7]。本研究結(jié)果顯示，模型組血清、肺組織TNF-α水平明顯較對(duì)照組高，可見(jiàn)TNF-α參與COPD的發(fā)病機(jī)制及炎癥反應(yīng)過(guò)程。INF-γ為調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的小分子多肽，主要由CD4+T細(xì)胞中Th1細(xì)胞產(chǎn)生，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫，可調(diào)節(jié)免疫網(wǎng)絡(luò)中其他細(xì)胞生物活性，對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)的啟動(dòng)、表現(xiàn)及免疫反應(yīng)強(qiáng)弱起重要作用。研究表明[8]，INF-γ可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)炎癥細(xì)胞滲出；INF-γ還可刺激單核巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，繼而激活中性粒細(xì)胞，促進(jìn)炎癥介質(zhì)及炎性蛋白釋放，進(jìn)而參與炎癥反應(yīng)過(guò)程。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)[7]，INF-γ可調(diào)節(jié)細(xì)胞趨化因子表達(dá)，誘導(dǎo)MMP-12產(chǎn)生，抑制分泌型蛋白酶抑制劑產(chǎn)生，繼而促進(jìn)COPD氣道炎癥。本研究結(jié)果表明，模型組血清、肺組織INF-γ水平顯著較對(duì)照組高，血清、肺組織中TNF-α水平及INF-γ水平均與氣道阻力呈正相關(guān)。可見(jiàn)TNF-α和INF-γ為COPD發(fā)病過(guò)程中的重要促炎因子，是引起氣道受阻的關(guān)鍵之一。

IL-10是一種重要抑炎因子，可對(duì)中性粒細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子產(chǎn)生抑制作用，尤其是抑制IL-1、IL-6及TNF-α等細(xì)胞因子，繼而抑制氣道炎癥反應(yīng)。有關(guān)其抑制炎癥因子機(jī)制尚不明確，目前初步認(rèn)為該抑制作用主要發(fā)生于mRNA轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，且在吸煙人群及COPD患者痰液中IL-10表達(dá)均下降。根據(jù)以上數(shù)據(jù)可以看出，模型組大鼠血清和肺組織中的IL-10水平明顯低于對(duì)照組，且經(jīng)相關(guān)性分析，IL-10水平與氣道阻力呈負(fù)相關(guān)性。與張曉軍等[9]研究結(jié)果相似。故初步認(rèn)為，在COPD自然病程中，IL-10的下調(diào)可加重炎癥，促使氣道重構(gòu)[10]。

綜上所述，TNF-α和INF-γ作為重要的促炎因子，通過(guò)其在體內(nèi)表達(dá)情況可間接反應(yīng)COPD疾病進(jìn)展情況。IL-10為重要的抗炎因子，在COPD呼吸道炎癥反應(yīng)機(jī)制中起保護(hù)作用。故臨床可通過(guò)監(jiān)測(cè)、調(diào)控IL-10表達(dá)，作為COPD患者氣道炎癥反應(yīng)臨床防治的新思路。