郝文濤 楊亞玲 張海雁

卵巢癌是當(dāng)前婦科惡性腫瘤患者死亡的主要原因，由于在早期缺少典型的癥狀，被確診時(shí)大都處于腫瘤晚期，5年生存率維持在30%左右[1-2]。漿液性卵巢癌為具有惡性潛能的卵巢上皮性腫瘤，也是卵巢癌的常見(jiàn)類(lèi)型，具有間質(zhì)細(xì)胞瘤特征，當(dāng)前在我國(guó)的發(fā)病有逐年升高的趨勢(shì)[3]。當(dāng)前對(duì)于漿液性卵巢癌缺乏早期有效的診斷方法，找到一種有效的早期生物學(xué)標(biāo)志物是目前臨床研究的重點(diǎn)[4]。MircoRNAs(miRNAs)是長(zhǎng)21～23 nt的非編碼短鏈RNA，通過(guò)堿基配對(duì)的方式作用于相應(yīng)靶mRNA，導(dǎo)致靶mRNA轉(zhuǎn)錄后抑制或降解[5-6]。miRNAs通過(guò)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖凋亡等多種途徑在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用[7-8]，特別是miRNAs可通過(guò)靶向誘導(dǎo)作用于轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑系統(tǒng)中，調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯[9]。卵巢癌組織、患者血清及外周血小體中檢測(cè)到多種miRNAs的異常表達(dá)，其中表達(dá)有顯著變化的有miRNA-200b及miRNA-21、miR-125b、miR-140等[10-11]。本研究以不同患者的血清標(biāo)本作為對(duì)象，探討了血漿miRNA-200b及miRNA-21在漿液性卵巢癌中的表達(dá)特點(diǎn)，現(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

研究時(shí)間為2013年8月到2017年12月，采用回顧性、總結(jié)研究方法，選擇在我院接受手術(shù)切除的漿液性卵巢癌患者60例作為卵巢癌組，同時(shí)選取同期患有良性上皮性卵巢腫瘤患者50例作為良性組，選擇具有正常卵巢組織的40例患者作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料完整；所有患者術(shù)后均經(jīng)病理結(jié)果證實(shí)；所有標(biāo)本在采集后進(jìn)行液氮保存；術(shù)前均未接受放、化療及其他治療；患者在自愿條件下簽署了知情同意書(shū)；采集血清標(biāo)本前都經(jīng)過(guò)中醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料缺項(xiàng)者；妊娠與哺乳期患者。

卵巢癌組患者年齡23～68歲，平均年齡(45.61±2.48)歲；平均病程(4.11±1.14)年；平均體重指數(shù)(21.48±2.77)kg/m2；臨床分期：Ⅰ期34例，Ⅱ期20例，Ⅲ期6例；組織學(xué)分化程度：高分化30例，中分化20例，低分化10例。良性組患者年齡22～70歲，平均年齡(44.21±3.19)歲；平均病程(1.89±0.29)年；平均體重指數(shù)(22.43±3.19)kg/m2。對(duì)照組患者年齡21～72歲，平均年齡(44.90±4.82)歲；平均體重指數(shù)(23.14±2.82)kg/m2。

3組年齡、體重指數(shù)對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 血漿miRNA-200b及miRNA-21檢測(cè)

取所有患者的全血樣本，低溫3 000 rpm/min離心10 min取血漿，每200 μl血漿樣本加入900 μl MZA裂解液，混勻到完全勻漿。室溫放置5 min后加入200 μl氯仿，劇烈振蕩15 s，低溫12 000 rpm/min 離心15 min；取水相，加入3倍體積的無(wú)水乙醇然后轉(zhuǎn)入吸附柱，12 000 rpm/min離心30 s；取吸附柱，加入700 μl去蛋白液MRD，12 000 rpm/min離心30 s；取吸附柱，加入漂洗液500 μl，2 000 rpm/min離心30 s；重復(fù)洗滌1次；取吸附柱，加入洗脫緩沖液50 μl,12 000 rpm/min離心30 s，取提取產(chǎn)物。提取的RNA的濃度測(cè)定及質(zhì)量鑒定，確保A260/A280>1.9。RNA樣本經(jīng)過(guò)加尾及反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行定量real-time PCR，配成25 μl反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用熒光定量PCR中的相對(duì)定量法進(jìn)行分析，每個(gè)標(biāo)本設(shè)3個(gè)平行管，重復(fù)3次。miRNA-200b正向引物：5'-GCGGTAGCTTATCAGACTGA-3'，反向引物：5'-TGCGTGTCGTGGAGTC-3'；miRNA-21正向引物：5'-CGCGGCAAAGTCCGAGGTTAT-3'，反向引物：5'-CGCGGAAACGTTACCATTA-3'。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

本研究的計(jì)量數(shù)據(jù)與計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.00軟件進(jìn)行分析，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差、率等表示，行t或卡方檢驗(yàn)，3組之間對(duì)比為Kruskall-Wallis檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用線性相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-21表達(dá)量對(duì)比

卵巢癌組中血漿miR-21相對(duì)表達(dá)量顯著高于良性組與對(duì)照組(P<0.05)，miR-21在良性組與對(duì)照組中的相對(duì)表達(dá)量對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

組別例數(shù)ΔCtΔΔCt2-ΔΔCt卵巢癌組6010.44±0.53?#-2.19±0.45?#4.85±1.24?#良性組5012.49±0.41-0.13±0.081.14±0.28對(duì)照組4012.63±0.43-0.09±0.021.09±0.14

注：#為與良性組對(duì)比，P<0.05；*為與對(duì)照組對(duì)比，P<0.05。

2.2 miRNA-200b表達(dá)量對(duì)比

卵巢癌組中血漿miRNA-200b相對(duì)表達(dá)量顯著高于良性組與對(duì)照組(P<0.05)，miRNA-200b在良性組與對(duì)照組中的相對(duì)表達(dá)量(2-ΔΔCt)對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

組別例數(shù)ΔCtΔΔCt2-ΔΔCt卵巢癌組6011.02±0.53?#-3.22±0.46?#5.58±1.33?#良性組5014.20±1.22-0.22±0.091.32±0.43對(duì)照組4013.22±1.44-0.21±0.031.21±0.14

注：#為與良性組對(duì)比，P<0.05；*為與對(duì)照組對(duì)比，P<0.05。

2.3 miRNA-200b及miRNA-21表達(dá)與卵巢癌臨床特征的相關(guān)性

不同臨床分期、分化程度卵巢癌患者的miRNA-200b及miRNA-21表達(dá)量對(duì)比,差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 miRNA-200b及miRNA-21表達(dá)與卵巢癌臨床特征的相關(guān)性

注：*為與Ⅰ期或高分化對(duì)比，P<0.05；#為與Ⅱ期或中分化對(duì)比，P<0.05。

2.4 相關(guān)性分析

在卵巢癌患者中，線性相關(guān)分析顯示血漿miRNA-200b與miRNA-21表達(dá)量呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(γ=0.562,P<0.05)。

3 討論

卵巢癌在我國(guó)發(fā)病率高，卵巢組織成分復(fù)雜，漿液性卵巢癌是比較常見(jiàn)的卵巢癌類(lèi)型，約占原發(fā)性卵巢腫瘤的1/3[12]，其早期臨床癥狀隱匿，多數(shù)者無(wú)明顯臨床癥狀，在確診時(shí)多為晚期，因此患者預(yù)后生存率低，為此早期診斷卵巢癌是提高患者遠(yuǎn)期生存率的有效途徑[13-14]。

miRNAs在多種腫瘤中均有表達(dá)，并在腫瘤發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。不同組織學(xué)類(lèi)型的卵巢癌的miRNAs譜不同，漿液性癌、黏液性癌、子宮內(nèi)膜樣癌，透明細(xì)胞癌的Ⅰ期卵巢癌miRNA的表達(dá)，透明細(xì)胞癌以高表達(dá)miR-30a-3p為特征，黏液性癌表現(xiàn)為高表達(dá)miR-192[15]。miRNAs在卵巢腫瘤組織與正常組織間的表達(dá)差異具有一定的普遍性，當(dāng)前研究表明miRNA-200家族在漿液性卵巢癌的發(fā)病機(jī)制中起著類(lèi)似癌基因的作用，可用于漿液性卵巢癌的早期診斷[16]。miRNA-200家族中miRNA-200b的過(guò)度表達(dá)顯著促進(jìn)了漿液性卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，并且它的高表達(dá)預(yù)示漿液性卵巢癌的不良預(yù)后。miRNA-21在卵巢癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌等多種標(biāo)本以及細(xì)胞系都有檢測(cè)出其水平異常升高，其能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因或轉(zhuǎn)移抑制基因的功能，從而發(fā)揮促癌作用[17]。本研究顯示卵巢癌組中血漿miR-21、miRNA-200b相對(duì)表達(dá)量顯著高于良性組與對(duì)照組(P<0.05)，miR-21、miRNA-200b在良性組與對(duì)照組中的相對(duì)表達(dá)量對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。當(dāng)前也有研究表明miR-21及miR-200家族的低表達(dá)能促進(jìn)卵巢腫瘤細(xì)胞的上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而提高細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力[18]。miRNA-200b的表達(dá)升高與卵巢癌的化療耐藥性有直接關(guān)系，miRNA-200b能夠抑制具有促進(jìn)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程的基因表達(dá)。

miRNAs與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，較多的癌基因、抑癌基因以及和細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管形成等有關(guān)的基因均不同程度地受miRNA的調(diào)控，但目前有關(guān)卵巢組織miRNAs的研究相對(duì)較少。在卵巢腫瘤中，一些miRNA表達(dá)升高和一些miRNA低表達(dá)。有學(xué)者研究了卵巢上皮性腫瘤患者的miRNAs表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)倍數(shù)最高的包括miR-200b、miR-141，下調(diào)倍數(shù)最高的有miR-199a、miR-140等[19]。本研究顯示不同臨床分期、分化程度卵巢癌患者的miRNA-200b及miRNA-21表達(dá)量對(duì)比差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。有研究顯示miRNA-200b定位1號(hào)染色體，與漿液性卵巢癌的復(fù)發(fā)和總生存期顯著相關(guān)[20]。還有研究發(fā)現(xiàn)上皮性卵巢癌組織的miR-21的相對(duì)表達(dá)量明顯高于良性腫瘤及正常對(duì)照組，miR-21參與了腫瘤細(xì)胞的侵襲、血管浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的過(guò)程[21]。

miRNA在真核生物中可通過(guò)與靶mRNAs分子中3'-非翻譯區(qū)結(jié)合后，使mRANs結(jié)構(gòu)改變，從而調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞的分化、增殖、凋亡等一系列生理與病理過(guò)程。miR-21參與調(diào)節(jié)多種惡性腫瘤的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等過(guò)程，miR-21通過(guò)參與卵巢癌間質(zhì)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化影響卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展[22]。本研究直線相關(guān)分析顯示卵巢癌血漿miRNA-200b與miRNA-21表達(dá)量成正相關(guān)性(P<0.05)。不過(guò)同一種miRNA在不同腫瘤中表達(dá)是不同的，可能由于一種miRNAs調(diào)控多種靶基因，miRNAs的表達(dá)又是受多基因調(diào)控的結(jié)果，且靶基因的功能又是多種多樣的，所以miRNAs可表現(xiàn)出組織特異性[23]。

總之，血漿miRNA-200b與miRNA-21在卵巢癌中呈現(xiàn)高表達(dá)狀況，與卵巢癌的臨床分期與組織學(xué)分化程度顯著相關(guān)，兩者可相互影響，在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮癌基因的功能。