韓 智 龔 蕾 王會(huì)霞 朱曉玲 吳婉琴 劉國(guó)姣 王 彬

(1.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北 武漢 430070；2.湖北省食品質(zhì)量安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430070)

近年來，中國(guó)保健食品產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，2018年全國(guó)保健食品市場(chǎng)產(chǎn)值達(dá)到4 000億元[1]。一些不法分子為獲取高額利潤(rùn)在保健食品中非法添加化學(xué)藥物，以增強(qiáng)其宣稱的功效，可能導(dǎo)致消費(fèi)者發(fā)生輕微中毒，嚴(yán)重的甚至危及生命[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)[1]，2017年7月～2018年5月查處的保健食品違法行為中，非法經(jīng)營(yíng)行為占全部案件總數(shù)高達(dá)45.19%，其中又以非法添加藥物為主。

為遏制保健食品中非法添加西藥的行為，在2018版《國(guó)家食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則》[3]中，共有67種不同種類的非法添加西藥被列入日常監(jiān)督抽檢范圍，涉及12種不同檢驗(yàn)方法，但每種檢驗(yàn)方法的檢測(cè)成分較少。保健食品非法添加西藥常用的檢測(cè)方法有薄層色譜法[4-6]、酶聯(lián)免疫法[7-8]、HPLC法[9-11]、GC-MS法[12-13]、HPLC-MS/MS[14-16]，HPLC-TOF-MS[17-20]等，這些方法的開發(fā)對(duì)保健食品中非法添加西藥監(jiān)測(cè)提供很好的依據(jù)，但存在基質(zhì)背景干擾問題。

靜電場(chǎng)軌道阱(Orbitrap)技術(shù)是由俄國(guó)科學(xué)家[21]根據(jù)靜電場(chǎng)軌道阱發(fā)展的新型質(zhì)量分析器，具有高分辨率和高質(zhì)量精度的特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)食品中有毒有害物質(zhì)或功效成分等物質(zhì)的高通量篩查，已逐漸應(yīng)用于保健食品檢測(cè)中。張曉光等[22]利用Q-Exactive Orbitrap篩查保健食品中23種降壓非法添加西藥成分，各藥物檢出限為0.2～0.5 μg/kg；劉蕓等[23]利用Q Exative Orbitrap對(duì)4類共31種保健食品進(jìn)行42種非法添加西藥進(jìn)行了篩查及定量測(cè)定，檢出限為1.0～10.0 ng/mL，檢出其中3種添加了非法藥物。

目前采用高分辨質(zhì)譜對(duì)保健食品中非法添加物的篩查研究較少，且基本都是某一類或者幾類樣品單獨(dú)分析[22-23]，有必要建立一個(gè)高通量篩查方法，提高檢測(cè)效率。本試驗(yàn)擬對(duì)73種保健食品中非法添加物作為研究對(duì)象，旨在建立一種簡(jiǎn)單且快速的高通量定性篩查和準(zhǔn)確定量方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

保健食品：市售；

西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N-N-雙去甲基西布曲明等73種化學(xué)藥物標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥95%，中國(guó)食品藥品檢定研究院；

乙腈：色譜級(jí)，德國(guó)Merck公司；

甲酸：色譜級(jí)，美國(guó)Thermo Fishers公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀：Orbitrap Fusion型，美國(guó)Thermo Fisher公司；

色譜柱：Waters Acquity UPLC HSS T3型，100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國(guó)Waters公司；

超純水器：Milli-Q型，法國(guó)密理博公司；

高速離心機(jī)：Avanti JXN-30型，美國(guó)Beckman Coulter公司；

電子天平：ME204型，梅特勒—托利多儀器有限公司；

數(shù)控超聲波清洗器：2600T型，上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理 參考BJS 201710《保健食品中75種非法添加化學(xué)藥物的檢測(cè)》[24]，準(zhǔn)確稱取1 g樣品，準(zhǔn)確加入10 mL甲醇，渦旋混勻，超聲提取15 min，4 500 r/min 離心8 min，取上清液過濾膜，供Orbitrap Fusion高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定。

1.3.2 色譜條件優(yōu)化

(1)色譜柱條件優(yōu)化：比較了不同粒徑及長(zhǎng)度的C18色譜柱，包括Waters Acquity HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)，Waters Acquity HSS T3(2.1 mm×50 mm,1.8 μm)，Thermo Accucore aQ(2.1 mm×100 mm,2.6 μm)，Thermo Hypersill GOLD(2.1 mm×150 mm,3.0 μm)，Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)，Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)，發(fā)現(xiàn)Waters Acquity HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)柱的峰形較好，對(duì)強(qiáng)極性物質(zhì)保留好，峰形好，分離度高，因此本研究選用此色譜柱。

(2)流動(dòng)相條件優(yōu)化：比較了不同流動(dòng)相及洗脫梯度對(duì)化合物的分離效果，最終確定流動(dòng)相：A為乙腈；B為水(含0.1%甲酸)。梯度洗脫程序：0.0～3.0 min，2% A；3.0～12.0 min，2%～95% A；12.0～15.0 min，95% A；15.0～15.1 min，95%～2% A；15.1～20.0 min，2% A。流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積5 μL。

1.3.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化 本研究采用Full-scan ddMS2采集數(shù)據(jù)，為避免漏檢化合物，將目標(biāo)母離子精確分子量預(yù)先輸入到目標(biāo)離子框中，優(yōu)先掃描指定m/z，達(dá)到設(shè)定閾值后觸發(fā)二級(jí)碎裂；利用四級(jí)桿隔離將m/z窗口設(shè)置為100～1 000，以減少其他雜質(zhì)離子進(jìn)入檢測(cè)器中。經(jīng)過系列參數(shù)篩選后，儀器將選取符合條件且信號(hào)最強(qiáng)的母離子進(jìn)行子離子掃描，使用Orbitrap質(zhì)量分析器檢測(cè)子離子，由此得到高分辨數(shù)據(jù)。為了使分析物的數(shù)據(jù)質(zhì)量達(dá)到最優(yōu)，進(jìn)行了分辨率、碰撞能量等參數(shù)的優(yōu)化。優(yōu)化后的參數(shù)如下：全掃描分辨率R=120 000、二級(jí)掃描分辨率R=60 000，自動(dòng)增益控制目標(biāo)離子數(shù)(AGC)為5×105，質(zhì)量偏差窗口為5×10-6，高能碰撞裂解(HCD)碎裂能量為(45±15)%，離子源溫度325 ℃，離子傳輸桿溫度350 ℃，鞘氣265 kPa，輔助氣70 kPa。

2 結(jié)果分析

2.1 篩查方法建立

按照1.3的方法優(yōu)化后，73種化合物的保留時(shí)間、母離子、碎片離子等信息見表1。在優(yōu)化的質(zhì)譜色譜條件下，73種化合物在20 min內(nèi)都得較好的分離。盡管有一些化合物保留時(shí)間較為相同，如西布曲明和去甲基他達(dá)那非，保留時(shí)間同為8.54 min，但是質(zhì)荷比有差異，使得很容易區(qū)分，見圖1。一些化合物為同分異構(gòu)體，如偽伐地那非和那莫西地那非為同分異構(gòu)體，質(zhì)荷比相同，但是保留時(shí)間不一致，偽伐地那非保留時(shí)間為9.52 min，那莫西地那非為10.57 min，通過保留時(shí)間差異，也可進(jìn)行準(zhǔn)確定性分析，見圖2。

利用優(yōu)化好的質(zhì)譜條件采集標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)，采用Xcalibur軟件提取離子信息，用Trace Finder軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)庫(kù)包含73種化合物的電離模式、母離子質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間、二級(jí)特征碎片離子。

2.2 定性及定量

2018年，《食品中那非類物質(zhì)的測(cè)定》食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法的公告[25]指出，使用高分辨定性判定需要在試樣中檢出與某標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰(或由標(biāo)準(zhǔn)品建立的譜庫(kù))保留時(shí)間一致的色譜峰，并且與標(biāo)準(zhǔn)品母離子精確分子量誤差不超過5×10-6，主要碎片離子精確分子量誤差不超過10-5。從表1可以看出，本研究得到的數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)容能夠滿足高通量快速篩查定性的要求。定量方法采用外標(biāo)法，將目標(biāo)物母離子峰面積為縱坐標(biāo)y，以目標(biāo)物的濃度為橫坐標(biāo)x，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測(cè)物母離子峰面積進(jìn)行定量計(jì)算。

圖1 西布曲明和去甲基他達(dá)那非提取離子流圖Figure 1 Extracted chromatograms of sibutramine and nortadalafil

表1 73種化合物參數(shù)Table 1 Parameters of 73 compounds

續(xù)表1

化合物名稱分子式保留時(shí)間掃描模式母離子(m/z)碎片離子(m/z)巴比妥C8H12N2O36.76[M-H]-183.07752140.0717,94.0662苯巴比妥C12H12N2O37.90[M-H]-231.07752188.0717,85.0044司可巴比妥C12H18N2O38.84[M-H]-237.12447194.1187,85.0044異戊巴比妥C11H18N2O38.59[M-H]-225.12447157.0608,111.1168氯美扎酮C11H12ClNO3S8.30[M+H]+274.02992154.0418,209.0602佐匹克隆C17H17ClN6O36.97[M+H]+389.11234245.0225,130.0053氯苯那敏C16H19ClN27.30[M+H]+275.13095230.0731,167.0730扎來普隆C17H15N5O8.54[M+H]+306.13494264.1244,236.0904文法拉辛C17H27NO27.47[M+H]+278.21146215.1430,121.0648青藤堿C19H23NO46.26[M+H]+330.16998181.0648,153.0700羅通定C21H25NO47.48[M+H]+356.18563165.0911,192.1018褪黑素C13H16N2O27.68[M+H]+233.12845174.0908,131.0726奧沙西泮C15H11ClN2O28.65[M+H]+287.05818241.0527,163.0058勞拉西泮C15H10Cl2N2O27.59[M+H]+321.01921289.0294,177.0214尼群地平C18H20N2O610.04[M-H]-359.12486226.0863,210.0913尼莫地平C21H26N2O710.22[M-H]-417.16672301.0819,255.0890尼索地平C20H24N2O610.41[M+H]+389.17073211.0850,183.0912非洛地平C18H19Cl2NO410.63[M-H]-382.06184278.0134,243.0445氫氯噻嗪C7H8ClN3O4S26.32[M-H]-295.95720204.9833,157.0162哌唑嗪C19H21N5O47.13[M+H]+384.16663247.1190,138.0550利血平C33H40N2O98.45[M+H]+609.28066448.1967,397.2122卡托普利C9H15NO3S7.10[M+H]+218.08454172.0792,116.0706可樂定C9H9Cl2N35.86[M+H]+230.02463212.9981,186.9824氨氯地平C20H25ClN2O58.13[M+H]+409.15248238.0629,294.0891硝苯地平C17H18N2O69.39[M+H]+347.12376315.0976,195.0917阿替洛爾C14H22N2O34.64[M+H]+267.17032190.0863,116.1070洛伐他汀C24H36O510.36[M+H]+405.26355199.1481,143.0855辛伐他汀C25H38O511.42[M+H]+419.27920199.1481,173.1325煙酸C6H5NO21.22[M+H]+124.0393078.0338,96.0444洛伐他汀羥酸鈉鹽C24H37NaO610.37[M-Na]-421.25956319.1902,101.0601美伐他汀C23H34O510.71[M+H]+391.24790155.0841,185.1316脫羥基洛伐他汀C24H34O411.90[M+H]+387.25299131.0862,199.1490那紅地那非C24H32N6O37.49[M+H]+453.26087297.1346,113.1073紅地那非C25H34N6O37.54[M+H]+467.27652297.1346,127.1230羥基豪莫西地那非C23H32N6O5S7.76[M+H]+505.2227799.0917,283.1190西地那非C22H30N6O4S7.80[M+H]+475.21220311.1503,283.1190氨基他達(dá)拉非C21H18N4O48.49[M+H]+391.14008269.1033,262.0863他達(dá)拉非C22H19N3O48.87[M+H]+390.14483268.1081,135.0441硫代艾地那非C23H32N6O3S28.75[M+H]+505.20501327.1274,299.0961,去甲基他達(dá)拉非C21H17N3O48.54[M+H]+376.12918302.0812,262.0862硫代西地那非C22H30N6O3S28.62[M+H]+491.18936100.0995,341.1424豪莫西地那非C23H32N6O4S7.85[M+H]+489.22785114.1152,311.1503伐地那非C23H32N6O4S7.42[M+H]+489.22785312.1581,151.0866偽伐地那非C22H29N5O4S9.54[M+H]+460.20130169.0974,312.1581那莫西地那非C22H29N5O4S10.55[M+H]+460.20130312.1581,283.1195

圖2 偽伐地那非和那莫西地那非提取離子流圖Figure 2 Extracted chromatograms of vardenafil and norneosildenafil

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)由分析物的共流出組分影響電噴霧接口的離子化效率所致，表現(xiàn)為離子增強(qiáng)或離子抑制作用，儀器的分辨率及抗干擾能力也影響基質(zhì)效應(yīng)，若有較強(qiáng)的基質(zhì)增強(qiáng)或基質(zhì)減弱效應(yīng)的一般采取基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。Orbitrap具有超高分辨率，背景噪音干擾極小，基質(zhì)效應(yīng)相對(duì)較低。為了進(jìn)一步明確保健食品中的基質(zhì)效應(yīng)，本研究驗(yàn)證了片劑、膠囊、口服液的基質(zhì)效應(yīng)，均在80%～120%，因此定量時(shí)不考慮基質(zhì)效應(yīng)帶來的影響。

2.4 線性關(guān)系及檢出限

采用Orbitrap高分辨質(zhì)譜對(duì)73種非法添加的西藥進(jìn)行定量分析，以目標(biāo)物母離子特征離子峰面積作為縱坐標(biāo)y，以目標(biāo)物的濃度為橫坐標(biāo)x，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所有化合物在一定的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R>0.99。在空白片劑樣品中添加低濃度的目標(biāo)化合物，檢出限(LOD)以S/N=3確定，S/N=10時(shí)對(duì)應(yīng)濃度為定量限，各化合物的檢出限及定量限見表2。

表2 各化合物檢出限及定量限Table 2 The LOD and LOQ of 73 compounds

續(xù)表2

化合物名稱線性范圍/(ng·mL-1)R檢出限/(μg·kg-1)定量限/(μg·kg-1)化合物名稱線性范圍/(ng·mL-1)R檢出限/(μg·kg-1)定量限/(μg·kg-1)氯硝西泮0.6～2000.99926羥基豪莫西地那非0.6～2000.99826三唑侖0.6～2000.99926西地那非0.6～2000.99826地西泮0.6～2000.99926氨基他達(dá)拉非1.5～3000.999515巴比妥6.0～5000.9982060他達(dá)那非0.6～2000.99926苯巴比妥6.0～5000.9982060硫代艾地那非1.5～3000.999515司可巴比妥6.0～5000.9982060去甲基他達(dá)拉非0.6～2000.99926異戊巴比妥6.0～5000.9992060硫代西地那非1.5～3000.999515氯美扎酮1.5～3000.998515豪莫西地那非0.6～2000.99926佐匹克隆1.5～3000.999515伐地那非0.6～2000.99926氯苯那敏1.5～3000.998515偽伐地那非0.6～2000.99826扎來普隆1.5～3000.999515那莫西地那非1.5～3000.998515文法拉辛1.5～3000.998515

2.5 回收率及精密度

在膠囊、片劑、口服劑3種保健食品基質(zhì)中按照100，500，1 000 μg/kg含量添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平重復(fù)3次。經(jīng)計(jì)算，其回收率為72.2%～117.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.3%～6.8%，表明該方法是一種適合不同基質(zhì)保健食品非法添加高通量快速篩查定量的方法。

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

利用本方法對(duì)市售28份保健食品進(jìn)行檢測(cè)，1批次檢出洛伐他汀，1批次檢出他達(dá)那非。

3 結(jié)論

本研究采用甲醇超聲提取，建立了保健食品中非法添加西藥成分高通量篩查及定量方法，該方法簡(jiǎn)單、快速，精密度及準(zhǔn)確性高，不僅可以作為快速篩查及定量73種化合物的方法，還可以根據(jù)檢測(cè)需求反復(fù)調(diào)用，進(jìn)行其他目標(biāo)化合物的靶向確證及非靶向篩查，擴(kuò)寬了數(shù)據(jù)的可利用性，但本研究的非法添加藥物種類仍然有限，今后應(yīng)不斷完善補(bǔ)充數(shù)據(jù)庫(kù)。