陳又銘 張慧君,2 郭 浩 沙迪昕 王一正

(1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省果蔬雜糧飲品工程技術(shù)研究中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

隨著現(xiàn)代科技的飛速發(fā)展，由于塑料制品的不可降解性導(dǎo)致的環(huán)境污染，已直接威脅到人們的健康及生活。

近年來，美國、歐盟、日本等發(fā)達國家十分重視可降解材料產(chǎn)業(yè)，特別是原料來自可再生資源或產(chǎn)業(yè)廢棄的可降解材料的發(fā)展[1]。作為一種生物可降解材料，玉米醇溶蛋白(zein)膜憑借良好的成膜性逐漸凸顯出來，玉米醇溶蛋白是玉米深加工的一種副產(chǎn)物，不需加入任何添加劑即可制成薄膜，該膜防潮、隔氧、抗紫外線、保香、不透油、防靜電等特性較好，在食品、醫(yī)藥、包裝等行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景[2]。

玉米醇溶蛋白膜的膜質(zhì)較脆，機械性能較差。蛋白質(zhì)改性是提高膜機械性能的一種常見方法，改性方法有物理改性、化學(xué)改性、酶法改性和基因工程改性。傳統(tǒng)方法通常選擇加入增塑劑的酰化改性，如張雪娜等[3]在玉米醇溶蛋白中添加增塑劑后制成薄膜，考察了其對荷蘭瓜的保鮮效果，結(jié)果表明玉米醇溶蛋白膜可有效減少果蔬的水分散失。崔和平等[4]研究了不同甘油含量對玉米醇溶蛋白膜儲藏穩(wěn)定性的影響，結(jié)果表明甘油含量為0.3 g/g的蛋白膜機械性能的穩(wěn)定性較好。但此種改性方法通常會有化學(xué)試劑殘留，同時?；男愿淖兞说鞍踪|(zhì)的結(jié)構(gòu)，有研究[5]表明此種改變會使蛋白質(zhì)的生物效價降低。而糖基化改性僅通過加熱使糖與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，改性產(chǎn)物的性能較好，并且具有一定的安全性。糖基化改性又分為干熱法和濕熱法，干熱法是蛋白質(zhì)與多糖基于固相體系發(fā)生的反應(yīng)，反應(yīng)時間長，但操作簡單；而濕熱法雖具有反應(yīng)時間短、速度快等優(yōu)點，但機械性能遠低于干熱法[6]。

菊粉(inulin)是由果糖分子通過β(2-1)鍵連接，末端含有一個葡萄糖分子的高分子碳水化合物，平均分子量5 500 Da[7]，是一種多聚果糖。菊粉作為天然功能性食品的配料，具有膳食纖維和益生元雙重功效，促進礦物質(zhì)吸收、維生素合成和預(yù)防癌癥等作用[8]。目前，采用糖基化改性玉米醇溶蛋白，制備成膜的研究較少，本研究擬采用菊粉對玉米醇溶蛋白進行干法糖基化改性，并將改性產(chǎn)物制成薄膜，通過對水蒸氣透過率、透光率、阻油性、阻氧性等性能的測定，為干法改性的玉米醇溶蛋白膜的后期應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

玉米醇溶蛋白：蛋白含量90%，自制；

菊粉：聚合度(DP)>10，純度>95%，佐源生物工程科技有限公司；

α-淀粉酶：7×104U/mL，寧夏夏盛實業(yè)集團有限公司；

鄰苯二甲醛：化學(xué)純，天津市光復(fù)精細化工研究所；

十二烷基硫酸鈉：電泳級，天津市耀華化學(xué)試劑公司；

β-巰基乙醇：分析純，天津市北聯(lián)精細化學(xué)品開發(fā)公司；

硼砂：分析純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；

硫代硫酸鈉：分析純，天津市博迪化工有限公司；

三氯甲烷：分析純，天津市富宇精細化工有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

質(zhì)構(gòu)儀：QTS-25型，美國博樂飛公司；

紫外可見分光光度計：L5型，上海儀電分析儀器有限公司；

超聲波信號發(fā)生器：WSL-1000D型，南京順流儀器有限公司；

真空冷凍干燥機：LYOQUEST-85型，西班牙泰士達公司；

超低溫冰箱：Thermo702型，賽默飛世爾科技有限公司；

數(shù)顯膜測厚儀：GBCY01型，浙江盛泰芯電子科技有限公司；

隔水式恒溫培養(yǎng)箱：PXY-DHS-5008S型，北京市光明醫(yī)療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 原料預(yù)處理 取適量玉米黃粉(CGM)，經(jīng)酶法除淀粉、丙酮脫色后，用70%乙醇溶液浸提后得到上清液，用冰水浸提，冷凍干燥后得玉米醇溶蛋白樣品。

1.2.2 糖基化改性 稱取玉米醇溶蛋白，用70%乙醇溶液溶解，配制成一定濃度的玉米醇溶蛋白乙醇溶液，按比例加入一定質(zhì)量菊粉，混勻，調(diào)節(jié)體系pH，超聲，凍干，打磨成粉，置于60 ℃、相對濕度為79%的干燥器內(nèi)反應(yīng)一定時間，得玉米醇溶蛋白—菊粉糖基化改性產(chǎn)物。

1.2.3 改性成膜工藝優(yōu)化

(1)物料比(蛋白/糖)：在反應(yīng)溶液pH 6、反應(yīng)時間36 h條件下，考察物料比[5∶1，7.5∶1，10∶1，12.5∶1，15∶1 (g/g)]對玉米醇溶蛋白改性成膜的影響。

(2)pH：在物料比(蛋白/糖)10∶1 (g/g)、反應(yīng)時間36 h條件下，考察反應(yīng)溶液pH值(pH 4，6，8，10)對玉米醇溶蛋白改性成膜的影響。

(3)反應(yīng)時間：在物料比(蛋白/糖)10∶1 (g/g)、pH 6的條件下，考察糖基化反應(yīng)時間(24，36，48，60，72 h)對玉米醇溶蛋白改性成膜的影響。

(4)正交試驗優(yōu)化設(shè)計：在單因素基礎(chǔ)上以物料比(蛋白/糖)、pH、反應(yīng)時間為試驗因素，以膜的抗拉強度為指標，探索最佳工藝條件。

1.2.4 膜的制備 稱取糖基化改性產(chǎn)物，用70%乙醇溶解配成8%樣品溶液，溶膠后倒入模具于70 ℃烘干成膜。將膜置于30 ℃、相對濕度43%的干燥器內(nèi)平衡48 h，進行測定。

1.2.5 接枝度的測定 采用鄰苯二甲醛OPA法[9]。

(1)試劑①：0.080 0 g OPA，2 mL甲醇，6 mL水混合均勻。

(2)試劑②：10 mL SDS，0.1 mol/L硼砂100 mL，0.4 mLβ-巰基乙醇，加少量蒸餾水混合后，定容至200 mL。

(3)測定時，量取0.3 mL試劑①，3.7 mL試劑②和200 μL 樣品，35 ℃水浴下反應(yīng)2 min，以200 μL乙醇為空白對照，在340 nm波長處測其吸光值。采取同樣的方法，用賴氨酸代替樣品作標準曲線，依據(jù)賴氨酸的曲線圖計算得出樣品中游離氨基的含量C。按式(1)計算接枝度。

(1)

式中：

DG——接枝度，%；

C0——未改性前溶液中游離氨基含量，mol/L；

C1——改性后溶液中游離氨基含量，mol/L。

1.2.6 膜機械性能抗拉強度和斷裂伸長率的測定 將玉米醇溶蛋白膜及改性膜裁成矩形條狀(40 mm×10 mm)，隨機取10個點用數(shù)顯測厚儀準確測量其膜厚度，取平均值。質(zhì)構(gòu)儀夾距20 mm，拉伸速度5.0 mm/s，每種膜測3次取平均值，按式(2)計算抗拉強度。

(2)

式中：

TS——抗拉強度，MPa；

F——最大拉力，N；

L——膜樣品厚度，mm；

W——膜樣品寬度，mm。

1.2.7 水蒸氣透過系數(shù)的測定 采用杯式法測定膜的水蒸氣透過系數(shù)，根據(jù)GB 1037—1988，并略作修改：將無水氯化鈣(CaCl2)粉碎為粒度2 mm粉末，于200 ℃干燥箱中干燥 2 h，待冷卻后加入到試管中，使加入的CaCl2量至試管口5 mm 處為止。選擇均勻、無孔洞、無皺褶的膜將裝有CaCl2的試管封口再用石蠟將其密封，并將試管稱重。將稱重后的試管放入底部為去離子水的干燥器中(保持相對濕度 100%)，將干燥器放入25 ℃隔水式恒溫培養(yǎng)箱(純水在25 ℃時飽和水蒸氣壓為3.167 1 kPa)，使膜內(nèi)外兩側(cè)保持一定的蒸氣壓差。每隔24 h取出試管，將其稱重，按式(3)計算水蒸氣透過系數(shù)。

(3)

式中：

WVP——水蒸氣透過系數(shù)，g·mm/(m2·d·kPa)；

ΔP——水蒸氣壓差，kPa；

T——膜厚，mm；

ΔW——水增加量，g；

t——時間，h；

S——膜的面積，m2。

1.2.8 透明度的測定 根據(jù)文獻[10]，修改如下：將平衡后的膜裁剪成條狀(12 mm×40 mm)，將裁剪好的薄膜緊貼于比色皿(玻璃)外側(cè)，以空比色皿(玻璃)作對照，在460 nm波長下測定其透光率，以透光率的大小間接表示透明度。

1.2.9 阻氧性的測定 根據(jù)油脂過氧化值的大小，來評價膜的阻氧性。在250 mL容器中加入20.0 g新鮮花生油，用平衡后的膜覆蓋瓶口并用石蠟密封，將碘量瓶存放在60 ℃培養(yǎng)箱中陳化12 d，根據(jù)GB 5009.227—2016方法，測定花生油的過氧化值。過氧化值按式(4)計算。

(4)

式中：

POV——樣品中過氧化值，g/100 g；

V1——樣品消耗硫代硫酸鈉標準溶液的體積，mL；

V2——空白試劑消耗硫酸鈉標準溶液的體積，mL；

C——硫代硫酸鈉標準溶液的濃度，mol/L；

m——待滴定樣品的量，g。

1.2.10 阻油性的測定 根據(jù)透油系數(shù)的大小，來評價膜的阻油性。取一只潔凈干燥的試管，加入1.00 mL 新鮮花生油，挑選完整均勻的膜將試管口封住并用高熔點石蠟密封，將試管倒置于已稱重的濾紙上。將試管連同倒置試管的濾紙放置在相對濕度為50%的恒濕箱中，每隔3 d稱重1次，稱量得出濾紙質(zhì)量的變化，稱量至濾紙質(zhì)量不變?yōu)橹?。按?5)計算透油系數(shù)。

(5)

式中：

P0——透油系數(shù)，g·mm/(cm2·d)；

ΔW——濾紙質(zhì)量前后變化，g；

FT——膜厚度，mm；

S——膜面積，m2；

T——放置時間，d。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗均平行3次，圖像處理采用Excel軟件，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0 軟件，并進行Duncan多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 改性成膜工藝優(yōu)化

2.1.1 物料比(蛋白/糖)對玉米醇溶蛋白改性成膜的影響 由圖1可知，隨著物料比的增加，玉米醇溶蛋白—菊粉產(chǎn)物的接枝度增大，抗拉強度也逐漸增強。當物料比為10∶1 (g/g)時，接枝度和抗拉強度均達到最高。說明玉米醇溶蛋白和菊粉分子接觸碰撞幾率逐漸增加，反應(yīng)機會增多，接枝度增加，使得改性后的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[11]，增加其抗拉強度。繼續(xù)增加物料比，接枝度和抗拉強度都下降，可能是接枝部位的作用點被多余的物料包埋，無法進行有效的糖基化反應(yīng)[12]。綜合考慮選取最合適的物料比為10∶1 (g/g)。

圖1 物料比對膜抗拉強度和接枝度的影響Figure 1 Effect of different material ratio on tensile strength of film and degree of graft

2.1.2 pH對玉米醇溶蛋白改性成膜的影響 由圖2可知，干法糖基化反應(yīng)的最適pH值環(huán)境處于弱酸環(huán)境。當pH由5提高到6時，其接枝度達到最高，此時，糖基化反應(yīng)迅速，糖與蛋白的接枝反應(yīng)程度大大增加。隨著pH值的繼續(xù)增加，玉米醇溶蛋白—菊粉產(chǎn)物的接枝度開始下降，接枝反應(yīng)達到平衡狀態(tài)，說明改性產(chǎn)物在堿性條件下，會使蛋白質(zhì)發(fā)生水解，結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，不利于糖基化反應(yīng)的進行[13]。而抗拉強度呈先升高后降低的趨勢，當體系處于pH 6～7時，其抗拉強度達到最大值，此時膜的韌性最佳，繼續(xù)增加體系的pH值，會對糖基化反應(yīng)不利，使膜的抗拉強度下降50%左右。因此選擇pH 6的反應(yīng)溶液作為改性體系。

圖2 糖基化反應(yīng)溶液pH對膜抗拉強度和接枝度的影響Figure 2 Effect of different pH on tensile strength of film and degree of graft

2.1.3 反應(yīng)時間對玉米醇溶蛋白改性成膜的影響 由圖3 可知，隨著糖基化反應(yīng)時間的增加，改性產(chǎn)物的抗拉強度和接枝度均呈先增后減的趨勢，反應(yīng)開始后，不斷加熱使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)部分展開，多糖與蛋白質(zhì)受熱逐步接合，接枝度逐漸提高。當糖基化反應(yīng)時間達到36 h時，接枝度達到最大值，膜的抗拉強度效果較好，如果再繼續(xù)延長反應(yīng)時間，會破壞蛋白質(zhì)分子的一些賴氨酸，還會造成蛋白質(zhì)分子伸展，使分子間的相互作用力增強，造成蛋白質(zhì)凝聚和沉淀，而不利于接枝反應(yīng)[14]。綜合考慮，選擇糖基化反應(yīng)時間為36 h，此時的成膜效果和接枝度都相對較高。

圖3 糖基化反應(yīng)時間對膜抗拉強度和接枝度的影響Figure 3 Effect of different reaction time on tensile strength of film and degree of graft

2.1.4 正交試驗設(shè)計 在單因素試驗基礎(chǔ)上，以物料比、pH、反應(yīng)時間3個因素，采用正交試驗進一步優(yōu)化糖基化改性玉米醇溶蛋白成膜的工藝條件。正交試驗因素水平表和結(jié)果分析如表1、2所示。

由表2可知，各因素對菊粉改性玉米醇溶蛋白的影響程度依次是pH>物料比>加熱時間，最佳成膜條件為物料比10∶1 (g/g)，反應(yīng)溶液pH 6，反應(yīng)時間48 h，在此條件下制得玉米醇溶蛋白—菊粉共價交聯(lián)膜的抗拉強度為10.12 MPa，接枝率為37.5%。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Hactor levels table of orthogonal ezperiment

表2 正交試驗設(shè)計結(jié)果分析Table 2 The result analysis of orthogonal experiment

2.2 膜性能分析

水蒸氣透過率是考察膜的透氣性與膜擴散性的一個重要指標[15]。由表3可知，純玉米醇溶蛋白膜的水蒸氣透過率優(yōu)于改性后的膜，表明經(jīng)菊粉糖基化改性能夠有效改善原玉米醇溶蛋白膜的阻水性?？赡苁窃谔腔磻?yīng)的過程中形成的接枝產(chǎn)物中引入了一定量的多聚果糖，將玉米醇溶蛋白中所含的親水氨基酸包裹，使膜的結(jié)構(gòu)更加密實，有效地阻止其與水蒸汽接觸[16]，該結(jié)果與孫琳琳等[17]對脫脂豆粕膜水蒸氣透過系數(shù)的測定數(shù)值相比有顯著提高。另一方面，由于親水性的糖分子會吸引水分子從而產(chǎn)生具有黏性且不會脫落的復(fù)合物，進一步阻隔水蒸氣的進入，使水蒸氣覆蓋在膜的表面，降低了水蒸氣透過率。

膜的透明度與原料自身顏色、膜液濃度和添加助劑的種類及含量有關(guān)[18]。本研究結(jié)果表明，經(jīng)菊粉改性后制備的膜較純玉米醇溶蛋白膜透明度提高了2倍多，與文獻[19]結(jié)果一致，但透明度相對較低。另本研究后期主要應(yīng)用于制備膠囊殼方面，膠囊在使用過程中為了防止內(nèi)容物活性的降低，通常會添加遮光劑等，雖透光率較明膠膠囊略低，但仍符合使用規(guī)范。根據(jù)表3可以看出，改性后的玉米醇溶蛋白—菊粉膜的過氧化值與透油系數(shù)較改性前均有提高，說明糖基化改性可有效改善蛋白膜的分子結(jié)構(gòu)，使其內(nèi)部結(jié)構(gòu)更加緊密，阻礙氧分子或油脂分子的擴散，從而提高玉米醇溶蛋白膜的阻油性與阻氧性。

表3 膜性能檢測結(jié)果?Table 3 The testing result of film performance

? 同行字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論

本研究以玉米濕法生產(chǎn)淀粉的副產(chǎn)物——玉米醇溶蛋白為原料，探討菊粉糖基化改性的成膜工藝，并在最優(yōu)條件下對膜的基本性質(zhì)進行測定。結(jié)果表明，改性蛋白膜的各項性能均優(yōu)于純玉米醇溶蛋白膜，尤其是解決了玉米醇溶蛋白膜質(zhì)較脆的弊端，這一優(yōu)良的性能可使其替代明膠制備的膠囊殼。

本研究采用的還原糖——菊粉，相比其他多糖雖功能性優(yōu)異，但價格較高，后期研究中會篩選一些成本更低的多糖作為糖基化改性的羰基供體；此外，由于玉米醇溶蛋白膜在酸性條件下不溶，而溶于弱堿性或中性的溶液中，適宜制備腸溶膠囊殼，故后續(xù)將研究腸溶膠囊殼的制備及腸溶性的考察。