劉宗亮，張建東，彭 灣，吳素珍，肖 海

(贛南醫(yī)學院 1.基礎(chǔ)醫(yī)學院；2.第一附屬醫(yī)院，江西 贛州 341000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥，是導致終末期腎病的主要原因。隨著發(fā)病率的增加，DN是糖尿病患者慢性腎功能衰竭和死亡的主要原因[1]。腎纖維化是糖尿病腎病的重要特征之一。多種因子參與糖尿病腎纖維化過程，如轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming Growth Factor β1，TGF-β1)、細胞因子、趨化因子、生長因子等，其中TGF-β1是最為重要的促進腎纖維化的細胞因子[2]。研究表明TGF-β1可通過激活Smads信號轉(zhuǎn)導促進腎上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)換，從而導致腎纖維化，最終進展為腎功能不全[3]。迄今為止，除了通過控制血糖、血壓可以減緩DN進展外，還沒有較好的措施用于預(yù)防和治療糖尿病的腎臟病變。因此，尋找有效防治DN的新方法具有重要的實際意義。

二氫楊梅素(dihydromyricelin，DMY)是藤茶中主要的活性成分之一。既往研究表明DMY具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、抗腫瘤等多種生物活性[4]。此外，不同的糖尿病動物模型均證實了DMY具有降血糖作用，能有效改善糖耐量異常狀態(tài)[5]。然而，DMY對高糖誘導的腎纖維化的作用機制尚不清楚[6]。本文通過建立DN大鼠模型，探討DMY對高糖誘導的大鼠腎纖維化的影響，并從TGF-β1/Smads信號通路來闡明DMY治療DN的分子機制。

1 材料與方法

1.1動物和試劑選取(200±20) g健康雄性SD大鼠40只，由贛南醫(yī)學院動物中心提供。將動物置于25 ℃環(huán)境下飼養(yǎng)，保持正常通風，自由飲水，常規(guī)飼料攝食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)、HE染色試劑盒、Masson染色試劑盒和PAS染色試劑盒均購于北京索萊寶公司，TGF-β1、Smad2和Smad7抗體均購于武漢博士德公司，二抗購于福州邁新公司，二氫楊梅素購于成都德思特公司。

1.2DN模型的制備和實驗分組所有大鼠禁食不禁水12 h后，將鏈脲佐菌素(STZ)溶于0.1 M檸檬酸鈉緩沖液(pH=4.5)中配制大劑量STZ，除正常對照組外均采用55 mg·kg-1STZ一次性腹腔注射并給以普通飼料喂養(yǎng)建立DN模型。造模72 h后大鼠尾靜脈取血測空腹血糖，以血糖值>16.7 mmol·L-1視為建模成功。并將大鼠隨機分為模型組和低、中、高劑量DMY組(125、250、500 mg·kg-1)，另設(shè)正常組。DMY組采用灌胃給藥，模型組以等體積的生理鹽水灌胃，每天一次，持續(xù)12周。

1.3腎功能檢測在第12周處死大鼠前，收集24 h尿液，測定大鼠24 h尿蛋白(24 h-Pro)。采用腹主動脈取血，待血清自然析出后，3 000×g，4 ℃離心10 min，棄去不溶物，收集血清，嚴格按照實驗說明檢測大鼠血尿素氮(bloodurea nitrogen， BUN)和血肌酐(serum creatinine，Scr)的含量。

1.4HE染色腎包埋組織4 μm厚切片，將切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木素染色5 min，流水稍沖洗；鹽酸酒精分化3 s，流水沖洗1 min；氨水返藍，流水沖洗1 min；伊紅染色1 min，流水沖洗1 min；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.5PAS染色切片常規(guī)脫蠟至水，高碘酸溶液氧化10 min，蒸餾水沖洗1 min；雪夫試劑染色20 min，流水沖洗1 min；蘇木素染核5 min，流水沖洗1 min，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片。

1.6Masson染色切片常規(guī)脫蠟至水，品紅染色3 min，弱酸沖洗1 min；磷鉬酸分化1 min，弱酸沖洗1 min；苯胺藍染色2 min，弱酸沖洗1 min；常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片。

1.7Westernblot檢測蛋白水平取腎臟組織冰上勻漿，充分裂解1 h，取上清用BCA方法進行蛋白定量，將蛋白加入上樣緩沖液煮沸變性，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，用PVDF膜進行蛋白電轉(zhuǎn)移，5%脫脂牛奶封閉后，加入TGF-β1、Smad2、Smad7一抗4 ℃過夜，二抗室溫孵育1 h。最后用Bio-Rad軟件掃描蛋白條帶及測定灰度值，并與對照組結(jié)果進行對比。

2 結(jié) 果

2.1DMY對DN大鼠腎功能的影響生化檢測結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組24 h-Pro、BUN、Scr含量明顯升高(P<0.01)；DMY給藥12周后，各劑量DMY組相較于模型組，24 h-Pro、BUN、Scr水平明顯降低(P<0.01)。見表1。

2.2DMY對DN大鼠腎臟組織病理的影響HE染色顯示模型組大鼠腎臟組織可見腎小球體積增大，血管擴張充血，部分腎小管輕度萎縮或管腔擴張，上皮細胞腫脹，部分上皮細胞脫落。各劑量DMY組大鼠腎組織病變較模型組病變減輕，以中、高劑量組明顯。PAS染色結(jié)果顯示DMY干預(yù)后，能減輕腎小球基底膜增厚。Masson染色顯示模型組腎小球膠原纖維增生，各劑量DMY組治療后膠原纖維不同程度減少。見圖1。

表1 DMY對各組大鼠腎功能的影響

注：**P<0.01，與正常組比較；##P<0.01，與模型組比較。

①正常組；②模型組；③低劑量DMY組；④中劑量DMY組；⑤高劑量DMY組。

2.3DMY對DN大鼠腎組織中TGF-β1、Smad2和Smad7表達的影響Western blot檢測結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠腎組織TGF-β1、Smad2蛋白表達水平增加，Smad7蛋白表達水平下降(P<0.05)。與模型組比較，低、高劑量DMY組TGF-β1、Smad2蛋白出現(xiàn)不同程度的降低，而Smad7蛋白表達水平增加(P<0.05)。見圖2。

3 討 論

糖尿病腎病是糖尿病最嚴重的并發(fā)癥之一，在其發(fā)生發(fā)展過程中以腎小球肥大、基底膜增厚、細胞外基質(zhì)積聚和足細胞丟失為主要病理特點，最終導致腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化。TGF-β1及其調(diào)控因子在DN腎間質(zhì)纖維化進程中起著關(guān)鍵作用，但在DN期間能有效減輕腎纖維化的方法有待進一步研究。

DMY是一種二氫黃酮醇類黃酮化合物，其具有抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激、抗皮膚老化等作用。近年來發(fā)現(xiàn)DMY藥效學作用多樣，在降血糖、抑制纖維化以及保護神經(jīng)和心腦血管疾病具有重要藥用價值[7-10]。許妍妍[11]發(fā)現(xiàn)DMY對四氯化碳致肝纖維化大鼠具有顯著的保護作用，可能與抑制細胞外基質(zhì)生成有關(guān)。李加林等[12]發(fā)現(xiàn)DMY可抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞增殖，并降低細胞外基質(zhì)蛋白的表達。陳紅等[13]采用60 mg·kg-1STZ腹腔注射大鼠并正常喂養(yǎng)8周后建立DN模型，發(fā)現(xiàn)DMY能減輕糖尿病大鼠腎臟纖維化。然而，DMY對DN的作用機制尚未完全闡述清楚。本研究采用55 mg·kg-1STZ一次性腹腔注射大鼠并給以普通飼料喂養(yǎng)12周后建立DN模型。HE和PAS染色顯示模型組大鼠腎小球肥大、部分腎小管萎縮和基底膜增厚；Masson染色顯示模型組大鼠腎臟組織膠原蛋白廣泛沉積，這表明本文成功建立了DN大鼠模型。DMY干預(yù)后能明顯減輕上述病理病變。此外，本研究發(fā)現(xiàn)DMY能有效降低24 h-Pro、BUN、Scr水平。這些結(jié)果表明，DMY對糖尿病腎損傷具有明顯的保護作用。

A：各組TGF-β1、Smad2及Smad7蛋白水平； B：各組TGF-β1、Smad2及Smad7蛋白灰密度值，n=4。

腎纖維化是DN的主要病理特征之一，其病理過程表現(xiàn)為腎小球系膜擴張，細胞外基質(zhì)的廣泛沉積[14]。許多細胞因子參與腎纖維化病理過程，TGF-β1是最為重要的促進腎纖維化的細胞因子[15]。TGF-β1參與多種生物學過程，包括細胞增殖、分化、凋亡、自噬和細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生[16]。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1不僅可以促進細胞外基質(zhì)的合成，還可以激活Smad2蛋白誘導腎上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)換，從而導致腎間質(zhì)纖維化[17-19]。另外，TGF-β1中和抗體可減輕糖尿病腎間質(zhì)纖維化，并降低細胞外基質(zhì)的表達[20]。這些研究提示TGF-β1通路在糖尿病腎纖維化進程中發(fā)揮重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)DMY可降低糖尿病大鼠腎臟組織TGF-β1、Smad2蛋白水平，增加Smad7蛋白表達水平，提示DMY可通過TGF-β1/Smads通路抑制細胞外基質(zhì)表達，減輕大鼠腎臟組織纖維化。

綜上所述，DMY對STZ所誘發(fā)的DN大鼠的腎損傷具有明顯的保護作用，其機制可能與抑制TGF-β1/Smads通路的過度激活，從而減輕腎臟組織膠原蛋白的沉積，減輕大鼠腎臟組織纖維化有關(guān)。本研究通過建立DN大鼠模型明確了DMY具有抑制腎纖維化的作用，為預(yù)防和治療DN提供新的思路。