母應(yīng)春，姜 麗，蘇 偉

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025）

小曲酒主要是以高粱為原料，但也有用玉米、小麥等，以小曲為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)糖化與發(fā)酵再經(jīng)固態(tài)或液態(tài)蒸餾而生產(chǎn)的酒[1]，具有清香純正、醇甜柔和、自然協(xié)調(diào)的特點(diǎn)[2]。清香型小曲酒的香味組分以酯類和醇類為主，其次是有機(jī)酸和羰基化合物，其中乙酸乙酯含量占總體酯類物質(zhì)的50%以上，是構(gòu)成清香型小曲酒清香純正、香氣協(xié)調(diào)的主要成分[3-4]。揮發(fā)性酚類物質(zhì)是白酒中的重要香味物質(zhì)，這一類物質(zhì)對(duì)于酒的聞香、口味以及穩(wěn)定性等方面均具有重要的作用[5-6]。揮發(fā)性酚類物質(zhì)在白酒中的形成途徑可能是發(fā)酵原料中的木質(zhì)素降解或一些氨基酸在微生物作用下產(chǎn)生[7]，這類化合物在閾值范圍內(nèi)都具有特殊的香氣。

彝族小曲酒采用具有地方特色的原料加小曲糖化發(fā)酵釀制而成，感官上具有與清香型小曲酒相似的主要香氣成分，在當(dāng)?shù)仡H受歡迎。但是至今還未出現(xiàn)關(guān)于彝族小曲酒的香氣成分報(bào)道，有關(guān)彝族小曲酒香味形成的主要物質(zhì)也尚未得到具體的研究。本文采用固相微萃取（SPE）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用儀對(duì)彝族小曲酒Y1、Y2和R1的香氣成分進(jìn)行定性半定量檢測(cè)及揮發(fā)性酚類物質(zhì)的定性定量檢測(cè)比較分析，以期為彝族小曲酒的工業(yè)化生產(chǎn)和穩(wěn)定化發(fā)展提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：彝族小曲酒Y1、Y2（原料為高粱與玉米）、R1（原料為高粱），采集于貴州省當(dāng)?shù)鼐茝S。

試劑：無(wú)水乙醇（色譜純，美國(guó)天地公司）；乙酸丁酯（購(gòu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）；三氯甲烷(色譜純，美國(guó)天地)；愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、2,3-二氫苯并呋喃、對(duì)乙基苯酚、苯酚、2-甲酚、對(duì)甲苯酚、間甲苯酚(德國(guó)DR)。

儀器設(shè)備：氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（Trace GC Ultra-DSQ MS，美國(guó)賽默飛世爾）；C18固相萃取柱(1000 mg/6 mL，美國(guó)沃特世)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 香氣物質(zhì)的測(cè)定

用固相微萃取法（Solid-phase Microextraction,SPE）萃取Y1、Y2、R1中的揮發(fā)性成分，再用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Gas Chromatography-Mass Spectrometer）對(duì)其進(jìn)行分離和鑒定。揮發(fā)性成分提取：根據(jù)李俊等方法[8]，量取5 mL酒樣加入0.5 mL乙酸丁酯內(nèi)標(biāo)溶液，充分混勻后用于GC-MS分析，且在同等條件下測(cè)定并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

色譜分析：樣品通過(guò)色譜柱（HP-FFAP 50 m×200 μm，0.33 μm）進(jìn)行分離；程序升溫：50 ℃（1 min）；以6℃/min升溫到80℃（2 min）；再以6℃/min升溫到200℃（5 min）；再以20℃/min升溫到220℃（5 min）；進(jìn)樣口溫度(250 ℃)；載氣：He；流速：1.0 mL/min；樣液進(jìn)樣量：1.0 μL。

質(zhì)譜條件：離子源溫度：250℃；EI電離源；電子能量：70 eV；SIM模式掃描。對(duì)采集得到的各峰經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索，核對(duì)Nist2005和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，用峰面積歸一化法測(cè)定各化學(xué)成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.2 揮發(fā)性酚類物質(zhì)測(cè)定

依次用水、乙醇5 mL活化C18固相萃取柱，準(zhǔn)確吸取25.0 mL酒樣，加入25.0 mL蒸餾水混勻后，以5 mL/min的速度連續(xù)進(jìn)樣到C18柱，再用氮?dú)鈱18固相萃取柱吹2 min，完成樣酒在C18柱上的富集，最后用5 mL三氯甲烷∶甲苯(v∶v=90∶10)洗脫萃取柱，收集濾液定容至5 mL，供GC-MS分析。

色譜分析：DB-FFAP石英毛細(xì)柱(50 m×0.250 mm，0.25 μm)；升溫程序：100 ℃保持1 min，以6.0℃/min升溫到200℃保持5 min，再以20℃/min升溫到210℃保持10 min；載氣(He)流速1 mL/min；進(jìn)樣口溫度(230 ℃)；進(jìn)樣量1.0 μL。

質(zhì)譜條件：傳輸線溫度：230℃；離子源溫度：230℃；EI電離源；電了能量：70 eV；SIM模式掃描。對(duì)采集得到的各峰經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索，核對(duì)Nist2005和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，用峰面積歸一化法測(cè)定各化學(xué)成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析與處理采用SIMCA 13.0和Origin 8.0數(shù)據(jù)處理軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 小曲酒的主要香氣成分及相對(duì)含量

香氣成分是決定酒樣的香氣、口感和風(fēng)格的關(guān)鍵因素[9]。對(duì)Y1、Y2、R1 3種小曲酒進(jìn)行GC-MS測(cè)定分析，其香氣成分GC-MS總離子流圖和各香氣成分相對(duì)含量的鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1—圖4和表1。

圖1 彝族小曲酒Y1香氣成分總離子流圖

從表1可以看出，通過(guò)GC-MS檢測(cè)并經(jīng)譜庫(kù)（NIST）檢索共檢測(cè)出26種香氣成分，醇類8種、酯類7種、酸類8種、醛類3種。

圖2 彝族小曲酒Y2香氣成分總離子流圖

圖3 小曲酒R1香氣成分總離子流圖

在Y1所測(cè)得香氣成分中，醇類占總含量的32.28%，酯類占47.97%，酸類占16.43%。其中主要香氣成分為異戊醇（23.12%）、正丙醇（5.95%）、異丁酸乙酯（26.81%）、丁酸乙酯（17.7%）、乙酸（15.74%）和乙醛（2.67%）。

在Y2中，醇類占總含量的29.5%，酯類占52.07%，酸類占12.78%。其中主要香氣成分為異戊醇（24.31%）、異丁酸乙酯（28.69%）、丁酸乙酯（19.53%）、乙酸（11.56%）和乙醛（4.23%）。

在R1中，醇類占總含量的23.45%，酯類占44.74%，酸類占19.43%。其中主要香氣成分為異戊醇（10.85%）、異丁醇（9.5%）、乳酸乙酯（16.75%）、異丁酸乙酯（15.83%）、丁酸乙酯（10.68%）、乙酸（18.19%）和乙醛（7.84%）。

2.2 不同小曲酒樣香氣成分整體結(jié)構(gòu)的差異分析

主成分分析是無(wú)監(jiān)督分析，能反映數(shù)據(jù)整體最原始的情況[10]，而正交偏最小二乘法（OPLS-DA）是人為加入分組變量的有監(jiān)督分析，能強(qiáng)化組間差距并發(fā)現(xiàn)剔除異常樣品[11]。在對(duì)小曲酒Y1、Y2、R1香氣成分差異性分析的基礎(chǔ)上，采用主成分分析法、正交偏最小二乘法和單因素方差分析等多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)小曲酒Y1、Y2、R1整體結(jié)構(gòu)品質(zhì)進(jìn)行差異性分析，并篩選出影響小曲酒Y1、Y2、R1整體結(jié)構(gòu)品質(zhì)差異顯著相關(guān)的指標(biāo)。

表1 小曲酒Y1、Y2、R1香氣成分及相對(duì)含量表

圖4 3種小曲酒PCA分析圖

圖5 3種小曲酒OPLS-DA分析圖

通過(guò)圖4可以看出，小曲酒Y1、Y2分別與R1分布于Y軸不同側(cè)，而Y1與Y2都分布在同側(cè)，說(shuō)明Y1、Y2分別與R1組間差異非常明顯，而Y1與Y2差異明顯。Y1、Y2是原料為高粱和玉米的彝族小曲酒，而R1是原料為高粱的小曲酒，這說(shuō)明由于Y1、Y2與R1的原料不同而導(dǎo)致其香氣成分整體結(jié)構(gòu)的差異非常顯著，且因?yàn)橐妥逍∏粕a(chǎn)技術(shù)相對(duì)落后，導(dǎo)致酒質(zhì)不統(tǒng)一而造成Y1與Y2的差異。

為了消除組內(nèi)間的差異，進(jìn)一步采用正交偏最小二乘法分析，如圖5所示，Y1分布于第二象限，Y2分布于第一象限，R1分布于第三象限，在消除了組內(nèi)差異后，Y1、Y2、R1的香氣成分整體結(jié)構(gòu)的差異情況非常明顯。結(jié)合圖6可以定性的認(rèn)為，小曲酒Y1、Y2香氣成分中正丙醇、異戊醇、丁酸乙酯和異丁酸乙酯含量明顯高于R1；R1香氣成分中乙酸、乳酸乙酯、乙醛含量明顯高于Y1、Y2。

由圖6可知，與主成分相關(guān)系數(shù)越大的指標(biāo)離中心就越遠(yuǎn)，而相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值越大，則表明指標(biāo)與主成分聯(lián)系越緊密[12]，因此圖6中黑色圓點(diǎn)所代表的物質(zhì)與主成分聯(lián)系緊密。篩選出的與主成分聯(lián)系緊密的7種物質(zhì)分別為正丙醇、異戊醇、乙酸、丁酸乙酯、異丁酸乙酯、乳酸乙酯、乙醛。

圖6 OPLS-DA載荷圖

圖7 OPLS-DA VIP圖

無(wú)論是PCA分析圖還是OPLS-DA分析圖，都只能宏觀表現(xiàn)出Y1、Y2、R1間香氣成分整體結(jié)構(gòu)的差異情況，而OPLS-DA載荷圖和VIP圖（圖7）則是代表了其中全部物質(zhì)所占的權(quán)重，差異權(quán)重越大，VIP值越大，載荷圖中的點(diǎn)離中心越遠(yuǎn)[13]。而VIP值大于1的指標(biāo)和載荷圖中偏離中心較遠(yuǎn)的點(diǎn)一致，將上述7個(gè)篩選出的差異性顯著的物質(zhì)經(jīng)過(guò)SPSS 23.0進(jìn)行單因素方差分析驗(yàn)證，經(jīng)驗(yàn)證該7個(gè)物質(zhì)均為差異顯著物質(zhì)（P＜0.05）。VIP值見(jiàn)表2。

表2 OPLS-DA VIP值表

2.3 不同小曲酒樣差異顯著物質(zhì)的分析

將上述7個(gè)差異顯著香氣成分及其含量導(dǎo)入Origin 8.0作SD柱形圖（圖8）。

由圖8可知，7個(gè)差異性顯著的香氣成分中，小曲酒Y1、Y2含量明顯大于R1的有：

圖8 7種差異顯著物質(zhì)的SD柱形圖

①正丙醇：正丙醇、異戊醇、異丁醇、仲丁醇等高級(jí)醇是構(gòu)成雜醇油的主要成分，但也是白酒重要的呈香呈味物質(zhì)之一[14]。雜醇油是白酒中苦澀味的主要來(lái)源之一[15]，當(dāng)飲用酒中雜醇油含量過(guò)高時(shí)，會(huì)對(duì)人體造成麻醉及中毒，使人感到頭暈頭痛。國(guó)標(biāo)規(guī)定白酒中雜醇油含量不得超過(guò)150 mg/100 mL。由圖8可知，3組小曲酒均未超標(biāo)。高級(jí)醇尤其是正丙醇在一定的濃度范圍內(nèi)，會(huì)出現(xiàn)類似清香型小曲酒所特有的落口后干爽帶苦的特點(diǎn)，Y類酒的正丙醇含量明顯高于R1，文獻(xiàn)表明正丙醇含量與清香型小曲酒的干爽帶苦有直接關(guān)系[16]，由此說(shuō)明Y1、Y2具有清香型小曲酒的部分風(fēng)味特征。但Y1與Y2中正丙醇含量也存在較大差異，酵母菌在固態(tài)發(fā)酵中是正丙醇的主要產(chǎn)生菌，酵母菌總數(shù)與正丙醇含量成正相關(guān)[17]，所以推測(cè)Y1與Y2出現(xiàn)差異的原因是在發(fā)酵階段，原料工藝相同的Y1、Y2因?yàn)樯a(chǎn)規(guī)模小，設(shè)備簡(jiǎn)單，監(jiān)管力度不夠而導(dǎo)致彝族小曲酒的品質(zhì)有所差異。

②異戊醇：根據(jù)國(guó)標(biāo)對(duì)雜醇油含量的規(guī)定可看出，Y1、Y2中異戊醇含量都略微超標(biāo)。白酒中適量的高級(jí)醇能襯托酯香并賦予酒特殊香氣，使香氣更完美[18]。雜醇油的生成原因是由于原料中蛋白質(zhì)水解為氨基酸，氨基酸再經(jīng)酵母或糖化菌分泌的脫羧酶和脫氨基酶的作用而生成與氨基酸相應(yīng)的雜醇油[19]，而Y類酒是玉米與高粱混合釀造，R1是高粱釀造，所以推測(cè)是因?yàn)橐妥錣類酒中玉米與高粱為原料其蛋白質(zhì)含量高于R1而導(dǎo)致異戊醇含量差異極大。

③丁酸乙酯、異丁酸乙酯：丁酸乙酯具有蘋(píng)果香氣[20]，與異丁酸乙酯可以相互烘托，丁酸乙酯閾值低，對(duì)口感影響大[21]，適量的丁酸乙酯可賦予酒爽口的風(fēng)味，但過(guò)多則會(huì)產(chǎn)生脂肪臭味。Y類酒丁酸乙酯含量高于R1，又由于其閾值低，對(duì)彝族小曲酒口感的影響可能很大。其可能是由于彝族小曲酒原料為高粱與玉米，在發(fā)酵過(guò)程中玉米胚芽所含有的占原料重量5%左右的脂肪因氧化而容易產(chǎn)生異味帶入酒中。

7個(gè)差異性顯著的香氣成分中，R1含量明顯高于Y1、Y2的有：

①乳酸乙酯：乳酸乙酯與乙酸乙酯都是清香型小曲酒的特征成分，乳酸乙酯含量過(guò)低會(huì)使酒體香氣寡淡，使酒后味短[22]；由于乳酸乙酯沸點(diǎn)較高，若乳酸乙酯含量過(guò)高或超過(guò)乙酸乙酯含量，會(huì)使乙酸乙酯揮發(fā)性降低，對(duì)乙酸乙酯放香有一定的抑制作用[23]。由圖8可看出，添加了玉米為原料的彝族小曲酒對(duì)比高粱為原料的小曲酒，其乳酸乙酯含量明顯降低，可能是由于產(chǎn)生乳酸乙酯的是乳酸菌，其對(duì)玉米胚芽中的脂肪起到了一定的分解作用而導(dǎo)致生成的乳酸乙酯含量降低。

圖9 彝族小曲酒Y1揮發(fā)性酚類物質(zhì)總離子流圖

圖10 彝族小曲酒Y2揮發(fā)性酚類物質(zhì)總離子流圖

圖11 小曲酒R1揮發(fā)性酚類物質(zhì)總離子流圖

表3 Y1、Y2、R1揮發(fā)性酚類物質(zhì)含量表

②乙酸：乙酸是可利用的糖在醋酸菌的轉(zhuǎn)化下生成的，而在清香型白酒中有機(jī)酸里乙酸的含量最高，但若酸類物質(zhì)含量過(guò)高，會(huì)使酒質(zhì)口感粗糙，產(chǎn)生雜味，降低酒質(zhì)[24]。所以Y1、Y2的口感優(yōu)于R1，但Y1與Y2之間也出現(xiàn)了差異，其可能原因是彝族小曲酒生產(chǎn)品質(zhì)不穩(wěn)定造成的。

③乙醛：乙醛有較強(qiáng)的刺激性氣味，因沸點(diǎn)低、易揮發(fā)而有助于白酒放香，少量乙醛是白酒中有益的香氣成分，它與正丙醇共同組成了清香型小曲酒爽口帶苦的特點(diǎn)[25-26]。

2.4 不同小曲酒中揮發(fā)性酚類物質(zhì)分析

通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析了Y1、Y2、R1中的揮發(fā)性酚類物質(zhì)，為了酒樣檢測(cè)的穩(wěn)定性排除其他因素干擾，每個(gè)樣品做3次平行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)中所有的數(shù)據(jù)都是3次重復(fù)所得，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（見(jiàn)圖9、圖10、圖11、表3）。

因?yàn)閅1、Y2、R1原料中都含有高粱，而高粱外殼中獨(dú)有的單寧為復(fù)雜的高分子多元酚類化合物[27]。在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)帶入酒中，因而使酒中酚類物質(zhì)含量較高。

由表3可知，在Y1、Y2、R1中揮發(fā)性酚類物質(zhì)含量都相對(duì)較低，但Y類酒所測(cè)得的揮發(fā)性酚類物質(zhì)種類與含量都多于R1小曲酒。揮發(fā)性酚類物質(zhì)雖然含量很少，但呈香作用很大，它在百萬(wàn)分之一，甚至千萬(wàn)分之一的情況下就能使人感到強(qiáng)烈的香味[28]。其中4-乙基愈創(chuàng)木酚其主體為香蘭醛、阿魏酸及香蘭酸[29]，香蘭醛有香草豆的特殊香氣，具有世界性嗜好的一種非常愉快的清香味，能在酒中產(chǎn)生甜味；阿魏酸有輕微的香味和辛味，可以轉(zhuǎn)變成香蘭醛和香蘭酸[30]；香蘭酸雖然香味不及香蘭醛，但香味柔和，是很好的助香劑[31]。R1中僅檢出微量4-乙基愈創(chuàng)木酚，而Y類酒中不僅有且含量較高，所以彝族小曲酒Y1、Y2在此方面的風(fēng)味特征優(yōu)于小曲酒R1。

3 結(jié)論

采用GC-MS技術(shù)分析不同小曲酒的香氣成分，3種小曲酒樣中共檢測(cè)出香氣成分26種，其中在彝族小曲酒Y1、Y2和R1小曲酒中分別檢測(cè)出25種、24種、25種芳香化合物。用色譜峰面積歸一化定量計(jì)算出各香氣成分在3種酒樣中的相對(duì)含量，由分析可知，3種酒樣香氣的差異主要表現(xiàn)在香氣成分相對(duì)含量上；其中酯類化合物含量最高，分別占總成分的47.97%、52.07%、44.74%。通過(guò)對(duì)樣品香氣成分進(jìn)行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA），統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，正丙醇、異戊醇、乙酸、乙醛、丁酸乙酯、異丁酸乙酯、乳酸乙酯7種物質(zhì)對(duì)小曲酒的香氣物質(zhì)總含量的貢獻(xiàn)較大。不同原料生產(chǎn)的小曲酒中香氣物質(zhì)的相對(duì)含量和揮發(fā)性酚類物質(zhì)存在顯著差異，彝族Y類小曲酒中的揮發(fā)性酚類物質(zhì)種類與含量都多于R1小曲酒。此外，彝族小曲酒Y1、Y2之間的香氣成分和揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量也存在差異，可能是由于生產(chǎn)技術(shù)相對(duì)落后導(dǎo)致酒質(zhì)不統(tǒng)一。