魯 珍，王紅照，李恩中，胡 莉，張建設(shè)，郜勝勤

（1.黃淮學(xué)院生物工程系，河南駐馬店463000；2.河南豫坡酒業(yè)有限責(zé)任公司，河南駐馬店，463900）

醬香型白酒是我國的傳統(tǒng)香型，醬香突出，幽雅細(xì)膩，歷史悠久。醬香型白酒中的醬香風(fēng)味物質(zhì)主要來源于高溫大曲，高溫大曲制曲過程中醬香風(fēng)味物質(zhì)的形成與微生物發(fā)酵及其所代謝的酶系、美拉德反應(yīng)有著密切的聯(lián)系[1]。細(xì)菌、酵母是主要的生香微生物，但霉菌也能產(chǎn)生一些風(fēng)味物質(zhì)或風(fēng)味前體物質(zhì)，對醬香酒酒體的風(fēng)格特征具有一定貢獻(xiàn)[2]。霉菌參與醬香型白酒的全部生產(chǎn)過程，如分泌高活性的糖化酶、液化酶、蛋白酶等，是白酒發(fā)酵原料中淀粉等大分子物質(zhì)分解的主要動力之一[3]，并能為酵母菌的繁殖和發(fā)酵提供底物，轉(zhuǎn)化為乙醇和多種呈香風(fēng)味物質(zhì)，提升出酒率和優(yōu)級品率[4]。王曉丹等[5]從遵義地區(qū)的醬香型大曲中分離1株產(chǎn)多種酶并同時產(chǎn)多種香氣成分的霉菌，是醬香大曲微生物組成中的重要霉菌之一。

由于醬香香味成分復(fù)雜，與原料的成分和菌種代謝產(chǎn)物有密切聯(lián)系，而且醬香型酒的特征性風(fēng)味化合物研究尚未取得確切結(jié)果，嚴(yán)重制約了形成醬香風(fēng)味的各種微量成分的深入研究與應(yīng)用，嚴(yán)重影響醬香型白酒的科學(xué)理論發(fā)展，同時也限制了其生產(chǎn)規(guī)模的進(jìn)一步擴(kuò)大[6]。本研究從本地醬香高溫大曲中分離篩選出產(chǎn)醬香的霉菌菌株，并通過GCMS分析來確定霉菌對醬香型白酒風(fēng)味的貢獻(xiàn)，為本地白酒后期相關(guān)研究提供借鑒，以期對改善酒體質(zhì)量提供實(shí)際指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

本研究所用高溫大曲在駐馬店市西平縣某酒廠車間選取，大曲的采樣按“四分法”進(jìn)行取樣，于-18℃儲存?zhèn)溆?；所用高粱和麩皮皆為酒廠提供，保存于4℃冰箱中備用。

試劑：本研究所用試劑均為分析純及以上級別，溶液均由雙蒸水配制。

分離篩選培養(yǎng)基：馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基[7]。

液體種子培養(yǎng)基：20 g蔗糖，20 g蛋白胨，10 g酵母粉，1 L蒸餾水，加熱溶解，冷卻后調(diào)pH值至5.0～6.0，121 ℃滅菌20 min。

液體培養(yǎng)：菌株經(jīng)平板活化后，挑取少量菌體接種于液體培養(yǎng)基中，以28℃、120 r/min搖床培養(yǎng)2～3 d。

固體培養(yǎng)基：30 g高粱粉加蒸餾水15 mL，加入250 mL三角瓶中攪拌均勻，121℃滅菌20 min。

儀器設(shè)備：SHP-250FE型智能生化培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；LDKM-40KCS型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；UB102i型生物顯微鏡，重慶奧浦光電技術(shù)有限公司；JB5374-91型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺，蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；6890N/5975B氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國安捷倫公司，75 μm(Carboxen/PDMS)固相微萃取頭，美國Supelco公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 霉菌的分離純化培養(yǎng)

取已處理的大曲樣進(jìn)行梯度稀釋（10-1～10-5），涂布在培養(yǎng)基上35℃培養(yǎng)48 h。挑取具有霉菌特征的單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，然后接種到馬鈴薯斜面培養(yǎng)基上，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 霉菌的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)分析

在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲及其孢子形態(tài)特征，結(jié)合真菌鑒定手冊[8]，進(jìn)行霉菌種屬的初步判斷。

1.2.2.2 霉菌生理生化試驗(yàn)[9]

霉菌碳源的利用：用不含碳源的察氏培養(yǎng)基，加入5%的果糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖和乳糖分別培養(yǎng)，觀察霉菌利用碳源的生長情況。

霉菌氮源的利用：用不含氮源的察氏培養(yǎng)基，分別加入3%的尿素、硫酸銨、牛肉粉、大豆提取物、硝酸銨分別培養(yǎng)，觀察霉菌利用氮源的生長情況。

1.2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

由江蘇金斯瑞生物科技有限公司完成，使用BLAST方法將測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知真菌序列進(jìn)行同源性分析。

1.2.3 霉菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物氣質(zhì)分析

1.2.3.1 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的制備

無菌條件下，吸取10 mL液體培養(yǎng)基的菌株種子液，加入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，用棉塞塞緊瓶口，28℃恒溫發(fā)酵7 d。

1.2.3.2 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性成分提取

頂空固相微萃取的操作步驟：將放置于冷凍室的樣品先在室溫下解凍，再取4 g或6 g（根據(jù)頂空瓶的容積大小提取）固態(tài)發(fā)酵后的培養(yǎng)基加入頂空萃取瓶中，加蓋密封，在60℃恒溫條件下，先平衡10 min。將預(yù)先進(jìn)行高溫老化（240℃，30 min）后的SPME針頭插入頂空樣品瓶，推出萃取纖維頭，頂空萃取30 min，隨后于GC-MS進(jìn)樣口以240℃解析5 min[10-11]。

1.2.3.3 GC-MS條件[12]

色譜條件（GC）：J＆WDB-5石英毛細(xì)柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；以 He為載氣，恒定流速為1.0 mL/min，不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度240℃；程序升溫：初始溫度40℃，保持3 min；然后以5℃/min升至120℃，保持4 min，8℃/min的速率升溫到200℃，保持8min，10℃/min升至240℃，保持10min。

質(zhì)譜條件（MS）：電離方式為EI，電子能量70 eV；發(fā)射電流：350 μA；接口溫度250 ℃，離子源溫度230℃；掃描質(zhì)量范圍為33～450 u。

1.2.4 霉菌酶活的測定[13]

對分離篩選得到的霉菌進(jìn)行果膠酶、纖維素酶、淀粉酶、糖化酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶的測定并進(jìn)行比較。

具體方法為將分離得到的霉菌在斜面養(yǎng)基上活化2次，再接種到斜面培養(yǎng)基上于30℃條件下培養(yǎng)7 d，在無菌條件下加入5 mL的滅菌生理鹽水，用移液器反復(fù)沖洗孢子呈孢子懸浮液，取1 mL孢子懸浮液加入已滅菌的麩皮培養(yǎng)基中。在30℃條件下培養(yǎng)72 h，每隔12 h搖勻1次。培養(yǎng)好后，取相當(dāng)于10 g的絕干培養(yǎng)物于100 mL水中，在40℃水浴鍋中保溫1 h，每隔15 min攪拌1次，過濾，濾液為粗酶液，用于酶活測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離純化及形態(tài)鑒定

利用稀釋平板涂布法對高溫大曲中霉菌進(jìn)行分離純化，通過肉眼觀察對菌株的個體形態(tài)和菌落形態(tài)進(jìn)行辨認(rèn)，根據(jù)形狀、菌落表面干濕狀態(tài)、透明狀態(tài)、光澤度、顏色、附著程度篩選出1種菌落形態(tài)不同的菌株（B），如表1和圖1所示。

表1 霉菌宏觀形態(tài)描述

形態(tài)學(xué)觀察只能初步鑒別，需要進(jìn)一步進(jìn)行生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)分析，才能鑒定其種屬。

2.2 生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在碳源利用試驗(yàn)中，B菌對麥芽糖的利用效果最好，其次是果糖和蔗糖。在氮源利用試驗(yàn)中，B對牛肉粉、大豆粉、硝酸銨利用效果最好，其次是亞硝酸銨，對尿素的利用效果最差，如表2和表3所示。

2.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果（圖2）

圖1 B菌株鏡檢圖片和菌落形態(tài)

表2 碳源利用結(jié)果

表3 氮源利用結(jié)果

為了對所篩選菌株做進(jìn)一步鑒定，對系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，菌株B與Aspergillus niger序列相似性最高，為99%，結(jié)合形態(tài)及生理生化特征，確定B菌株為黑曲霉，有學(xué)者曾對茅臺酒大曲中的微生物群落進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果表明，在茅臺酒生產(chǎn)過程中微生物群落極其復(fù)雜，包括大量霉菌，其中黑曲霉所占比例最高[14]。

2.4 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性物質(zhì)檢測結(jié)果

圖2 B菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

霉菌在發(fā)酵過程中所生成的高級醇、醛、酮、酯等呈香物質(zhì)，是形成醬香酒風(fēng)味物質(zhì)及風(fēng)味前體物質(zhì)的重要來源[5]。本研究對霉菌進(jìn)行了模擬固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)，通過固相微萃取和氣相色譜分析技術(shù)，對固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的揮發(fā)性香味成分進(jìn)行測定并分析。結(jié)果表明，霉菌發(fā)酵產(chǎn)物中共檢測出43種成分，包括5種未知化合物。其中，檢測出的醛類物質(zhì)有4種，占香氣成分的4.4%；醇類物質(zhì)有5種，占香氣成分的9.29%；酸類成分有2種，占香氣成分的3.79%；酯類成分有4種，占香氣成分的2.72%；酚類成分有3種，占香氣成分的36.85%；呋喃類成分有2種，占香氣成分的5.86%；另外還有其他香味成分，如3-羥基-2-丙酮、乙苯、苯乙烯、塞舌爾烯等，占香氣成分的3.8%（表4）。

總的來說，酚類物質(zhì)、醇類物質(zhì)、呋喃類物質(zhì)所占的比例最高，醛類物質(zhì)、酸類物質(zhì)、酯類物質(zhì)和其他香氣成分所占比例較少。據(jù)此，我們推斷霉菌對固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物貢獻(xiàn)香味成分最多的物質(zhì)是酚類、醇類和呋喃類。酚類物質(zhì)中的2-甲氧基苯酚含量高達(dá)17.21%，呈現(xiàn)出較濃郁的甜香和木香。另外，愈創(chuàng)木酚含量也較高，高達(dá)14.88%。有研究發(fā)現(xiàn)，這種物質(zhì)具有煙熏風(fēng)味，是醬香型白酒中主要的酚類風(fēng)味物質(zhì)，同時具有抗氧化活性[15]。莫新良等[16]發(fā)現(xiàn)黃酒貯存期間，香草醛是4-乙烯基愈創(chuàng)木酚降解的主要產(chǎn)物，而香草醛具有甜香味。因此，含量較高的愈創(chuàng)木酚對后期白酒的陳化具有重要作用。楊玉波等[17]研究還發(fā)現(xiàn)苯乙醛和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的香氣活力值較高，是高粱蒸煮的重要香氣成分。

醇類的含量也較高，醇和酸會通過酯化反應(yīng)大量合成酯類，會賦予白酒更多的香味物質(zhì)，適量的高級醇能夠賦予白酒良好的感官特征。其中在醇類物質(zhì)中仲丁醇的含量最高，呈現(xiàn)出類似葡萄酒的風(fēng)味，其中乙醇的含量也較高，會呈現(xiàn)出類似玫瑰花和蜂蜜香味[18]。

呋喃類物質(zhì)是白酒中一類重要的呈香物質(zhì)[19]，本研究中檢測到的有2,3-二氫苯并呋喃和2-戊基呋喃2種物質(zhì)，其中2-戊基呋喃是主要的呈果香物質(zhì)，王曉丹等[5]從醬香型大曲中分離得到的霉菌中也發(fā)現(xiàn)此種物質(zhì)[4]。

酸類、醛類、酯類等物質(zhì)也是大曲中和白酒中的重要呈香物質(zhì)，其中酯類化合物有花香和水果香，醛類呈現(xiàn)出水果香味[20]。酸類物質(zhì)中的3-甲基丁酸有水果的香味，F(xiàn)an等[21]對兩種醬香型白酒進(jìn)行GC-O分析，發(fā)現(xiàn)3-甲基丁酸等是聞香強(qiáng)度最高的物質(zhì)。另外，其他揮發(fā)性物質(zhì)中3-羥基-2-丁酮的含量較高，有奶香味。徐丹等[22]對霉菌研究中發(fā)現(xiàn)，霉菌分泌的酶具有良好的蛋白質(zhì)分解能力，如總狀毛霉的蛋白酶活力較高，還可產(chǎn)生醬香風(fēng)味物質(zhì)吡嗪類的前體物質(zhì)3-羥基-2-丁酮。

2.5 霉菌酶活的測定結(jié)果

霉菌能夠分泌活力高的纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、糖化酶等多種酶，是實(shí)現(xiàn)固態(tài)糖化發(fā)酵的關(guān)鍵微生物，在酒醅發(fā)酵過程中具有重要的功能，直接關(guān)系到原料的利用及白酒風(fēng)味的形成，同時對大曲的成熟及風(fēng)味有積極的貢獻(xiàn)[23-25]。

表4 揮發(fā)性成分中呈香物質(zhì)及相對含量

表5 霉菌各種酶活力測定結(jié)果 (U/g)

本研究對醬香高溫大曲中的霉菌在固態(tài)釀造中起主要作用的酶進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)黑曲霉的產(chǎn)酶活力都較高，如黑曲霉分泌的中性蛋白酶活力可達(dá)2372.57 U/g（表5）。蛋白酶在發(fā)酵過程中可以催化生成多種呈香物質(zhì)，是醬香白酒風(fēng)味物質(zhì)及風(fēng)味前體物質(zhì)形成的重要酶類[26]。纖維素酶、α-淀粉酶和果膠酶的活力也較高，其中糖化酶的活力可達(dá)1059.13 U/g（表5），黑曲霉的糖化酶活力較高，有利于白酒釀造過程中縮短酒精發(fā)酵周期，提高酵母產(chǎn)酒能力，加強(qiáng)原料的利用率[27]。另外，黑曲霉是α-淀粉酶與酸性蛋白酶的主要來源，這兩種酶能在釀酒的高溫及酸或強(qiáng)酸性環(huán)境下發(fā)揮作用，還能產(chǎn)生活性較高的糖化酶[28]。黃永光等[29]研究發(fā)現(xiàn)，河內(nèi)白曲也常出現(xiàn)在醬香大曲中，通過對它的分泌胞外蛋白進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其能分泌釀酒所需的糖化酶、蛋白酶，提升出酒率與酒的品質(zhì)。

3 結(jié)論

本研究采用傳統(tǒng)分離霉菌的方法對高溫大曲中的霉菌進(jìn)行分離純化，成功篩選得到1株產(chǎn)香霉菌，利用形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)確定這種霉菌為黑曲霉；研究了該株霉菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中各種揮發(fā)性成分以及各種酶的活性，發(fā)現(xiàn)酚類物質(zhì)、醇類物質(zhì)和呋喃類物質(zhì)對風(fēng)味的貢獻(xiàn)最大，另外黑曲霉分泌的蛋白酶活力較高，有利于提高高溫大曲在醬香白酒過程中的作用。研究結(jié)果為下一步探索霉菌在醬香型白酒風(fēng)味物質(zhì)形成中所起的作用奠定基礎(chǔ)。