周 易，梁 蕾，孟曉暄，盧一艷，郭 君

(北京大學(xué)航天臨床醫(yī)學(xué)院 航天中心醫(yī)院超聲科，北京 100049)

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)是最常見的甲狀腺惡性腫瘤[1]。目前超聲是評估甲狀腺腫瘤的首選影像學(xué)方法，能夠全面評價甲狀腺結(jié)節(jié)的位置、大小、形態(tài)和性質(zhì)，且實時CEUS還能進(jìn)一步反映腫瘤微循環(huán)灌注情況。病理微血管密度(microvessel density， MVD)是常用的量化及預(yù)測腫瘤血管生成的指標(biāo)[2]。本研究探討PTC的CEUS特征及其與病理MVD的關(guān)系，旨在為評估PTC的侵襲性提供影像學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1—12月在我院接受診治并經(jīng)病理證實的52例PTC患者，男17例，女35例，年齡19～84歲，平均(42.7±12.9)歲。所有患者均接受手術(shù)切除+頸部淋巴結(jié)清掃，并根據(jù)病理檢查淋巴結(jié)結(jié)果分為轉(zhuǎn)移組(n=28)和未轉(zhuǎn)移組(n=24)。

1.2 儀器與方法

1.2.1 超聲檢查 采用Philips iU22彩色超聲診斷儀，L9-3探頭，頻率3～9 MHz。囑患者仰臥，充分暴露頸部。首先行二維超聲檢查，觀察甲狀腺結(jié)節(jié)的位置、大小、形態(tài)、邊界、縱橫比、內(nèi)部回聲、后方回聲、有無鈣化及與被膜接觸程度等；對可疑惡性結(jié)節(jié)行CEUS，選擇脈沖反相諧波造影條件，機(jī)械指數(shù)0.07，造影劑采用聲諾維，劑量2.4 ml，經(jīng)肘靜脈團(tuán)注，隨后注入5 ml生理鹽水。囑患者在注入造影劑后保持體位，不移動、不說話、勿吞咽；在注射造影劑的同時啟動圖像采集，選擇病灶最大縱切面，觀察甲狀腺病灶在160 s內(nèi)的回聲變化。

1.2.2 實時CEUS定量分析 采用QLAB定量分析軟件對甲狀腺ROI進(jìn)行動態(tài)分析，分別在結(jié)節(jié)中心區(qū)與周邊區(qū)放置取樣框，以結(jié)節(jié)最大徑的內(nèi)1/2類圓形區(qū)域為結(jié)節(jié)中心區(qū)，剩余環(huán)形區(qū)域為結(jié)節(jié)周邊區(qū)，然后描記結(jié)節(jié)輪廓；如結(jié)節(jié)與周圍正常組織分界不清或結(jié)節(jié)呈分葉狀，則以分界清楚部分確定最大徑，或包括分葉在內(nèi)選定最大徑。軟件自動獲得甲狀腺病變各部分血流灌注時間-強(qiáng)度曲線及定量參數(shù)，包括達(dá)峰時間(time to peak, TTP)、峰值強(qiáng)度(peak intensity, PI)、AUC以及擬合曲線上升支斜率和下降支斜率。

1.2.3 MVD計數(shù)方法 手術(shù)切除標(biāo)本均以10%甲醛溶液固定，常規(guī)處理后石蠟包埋，厚度4 μm連續(xù)切片，600℃烘烤過夜,并分別進(jìn)行HE和免疫組織化學(xué)染色。采用EnVision兩步法進(jìn)行CD34免疫組織化學(xué)染色。

本研究在Weidner計數(shù)方法的基礎(chǔ)上，采用Tissue FAXS PLUS(Tissue Gnostics GmbH)全景組織細(xì)胞定量分析系統(tǒng)進(jìn)行甲狀腺CD34免疫組織化學(xué)切片圖像采集和病灶內(nèi)MVD分析。以Tissue FAXS軟件自動識別組織區(qū)域，利用20倍物鏡對全玻片免疫組織化學(xué)圖像進(jìn)行多視野(單視野面積0.23 mm2)自動成像和圖像自動無縫拼接，最終獲取200倍組織全景圖及細(xì)胞解析度圖像；然后利用Strata Quest(Tissue Gnostics GmbH)軟件對結(jié)節(jié)中心和周邊區(qū)域(選擇方法同上)MVD進(jìn)行分析，獲得MVD計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，對轉(zhuǎn)移組與未轉(zhuǎn)移組間、結(jié)節(jié)中心與結(jié)節(jié)周邊采用t檢驗比較。采用Pearson相關(guān)分析評價病理MVD與CEUS指標(biāo)的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTC中CD34的表達(dá) PTC中，多數(shù)CD34陽性血管內(nèi)皮細(xì)胞位于乳頭的纖維血管軸心，呈節(jié)段性分布，濾泡亞型PTC常見微血管位于濾泡之間的間質(zhì)中；腫瘤內(nèi)壞死纖維區(qū)域多無陽性血管內(nèi)皮細(xì)胞，纖維結(jié)締組織呈非特異性著色，與背景分界不清；腫瘤周邊血管分布較密集，部分癌巢呈浸潤性生長，與周圍正常甲狀腺組織分界不清，也可呈非特異性著色(圖1、2)。

2.2 MVD比較 52例PTC中MVD分布不均，結(jié)節(jié)總體MDV計數(shù)平均值為(276.81±95.49)個/mm2，結(jié)節(jié)周邊區(qū)MVD計數(shù)平均值[(296.94±107.72)個/mm2]高于中心區(qū)平均值[(256.68±92.08)個/mm2]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.024,P=0.041)。轉(zhuǎn)移組結(jié)節(jié)周邊MVD計數(shù)高于未轉(zhuǎn)移組(P=0.039)，2組結(jié)節(jié)中心區(qū)MVD計數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.200)，見表1。

表1 轉(zhuǎn)移組與未轉(zhuǎn)移組PTC患者M(jìn)VD計數(shù)比較(個/mm2，±s)

表1 轉(zhuǎn)移組與未轉(zhuǎn)移組PTC患者M(jìn)VD計數(shù)比較(個/mm2，±s)

組別結(jié)節(jié)中心結(jié)節(jié)周邊轉(zhuǎn)移組(n=28)272.78±98.26325.80±103.57 未轉(zhuǎn)移組(n=24)230.58±74.33 249.64±89.03 t值1.3102.159P值0.2000.039

2.3 CEUS定量參數(shù)與MVD的相關(guān)性 結(jié)節(jié)周邊區(qū)時間-強(qiáng)度曲線AUC與結(jié)節(jié)周邊區(qū)、結(jié)節(jié)總體MVD計數(shù)呈正相關(guān)(r=0.45、0.41，P均<0.05)，余參數(shù)間均未見明顯相關(guān)性，見表2。

3 討論

常用MVD計數(shù)方法中，需避開腫塊內(nèi)出血、壞死及液化區(qū)域，計數(shù)腫瘤內(nèi)“熱點”的血管密度(high-MVD， hMVD)；但腫瘤周邊與正常組織接觸區(qū)域腫瘤生長活躍，新生血管豐富，腫瘤中心常發(fā)生壞死纖維

表2 PTC的CEUS定量參數(shù)與MVD計數(shù)的相關(guān)性

圖1 PTC患者，男，33歲，未轉(zhuǎn)移組 A.二維超聲示甲狀腺右葉中部低回聲結(jié)節(jié)，邊界清，形態(tài)規(guī)則； B.CEUS呈低增強(qiáng)； C.結(jié)節(jié)CD34染色全景圖像示結(jié)節(jié)中心區(qū)及周邊區(qū)可見多發(fā)壞死及纖維化區(qū)域(CD34染色，×10)； D.結(jié)節(jié)內(nèi)微血管呈特異性棕黃色染色，結(jié)節(jié)中心區(qū)MVD計數(shù)為85.88個/mm2，周邊區(qū)為99.93個/mm2(CD34染色，×200) 圖2 PTC患者，女，47歲，轉(zhuǎn)移組 A.二維超聲示甲狀腺右葉低回聲結(jié)節(jié)，邊界欠清，形態(tài)不規(guī)則，內(nèi)可見點狀鈣化； B.CEUS呈等增強(qiáng)； C.結(jié)節(jié)CD34染色全景圖像顯示結(jié)節(jié)微血管豐富(CD34染色，×10)； D.結(jié)節(jié)內(nèi)微血管呈特異性棕黃色染色，結(jié)節(jié)中心區(qū)MVD計數(shù)為395.55個/mm2，周邊區(qū)為417.71個/mm2(CD34染色，×200)

化，血供減少，且局部區(qū)域的MVD難以反映腫瘤的整體微血管灌注。本研究在既往MVD計數(shù)方法的基礎(chǔ)上，運用Tissue FAXS PLUS全景組織細(xì)胞定量分析系統(tǒng)，使計數(shù)區(qū)域與腫瘤CEUS分析區(qū)相對應(yīng)，在同一計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)下分別獲得腫瘤中心區(qū)與周邊區(qū)域整體MVD計數(shù)，能更加真實地反映腫瘤微血管的生成情況。

CEUS評估腫瘤內(nèi)MVD已廣泛用于肝臟腫瘤、前列腺癌、腎臟腫瘤等方面，且CEUS特征及定量參數(shù)與MVD具有相關(guān)性[3-6]。Du等[7]認(rèn)為乳腺病變中高M(jìn)VD組與低MVD組的CEUS模式不同，高M(jìn)VD組的CEUS表現(xiàn)為非均勻增強(qiáng)伴有灌注缺損。本研究也發(fā)現(xiàn)PTC結(jié)節(jié)MVD不均，周邊區(qū)MVD計數(shù)高于中心區(qū)，同時轉(zhuǎn)移組結(jié)節(jié)周邊MVD計數(shù)高于未轉(zhuǎn)移組。其原因可能是腫瘤新生毛細(xì)血管由腫瘤周圍宿主組織原有小血管壁發(fā)出，并由外向內(nèi)生長，腫瘤周邊細(xì)胞增殖活躍，但腫瘤細(xì)胞的生長速度快于微血管的形成速度，使中心區(qū)域易出現(xiàn)缺血壞死及血管重構(gòu)，故結(jié)節(jié)整體MVD有所差異，且結(jié)節(jié)中心區(qū)MVD通常低于結(jié)節(jié)周邊區(qū)；而發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC具有更高的侵襲性，代謝水平更高，周邊腫瘤細(xì)胞增殖更活躍，微循環(huán)灌注更豐富，故轉(zhuǎn)移組周邊MVD較未轉(zhuǎn)移組更高，而結(jié)節(jié)中心MVD無顯著性差異。

本研究發(fā)現(xiàn)PTC結(jié)節(jié)周邊區(qū)、結(jié)節(jié)總體MVD計數(shù)與結(jié)節(jié)周邊區(qū)時間-強(qiáng)度曲線的AUC呈正相關(guān)(r=0.45、0.41，P均<0.05)。Liu等[8]同樣發(fā)現(xiàn)乳腺癌CEUS周邊強(qiáng)化組的腫瘤周邊MVD明顯高于非周邊強(qiáng)化組。Kabakci等[9-12]認(rèn)為腫瘤CEUS定量分析時間-強(qiáng)度曲線中的AUC參數(shù)與腫瘤MVD相關(guān)。腫瘤內(nèi)微血管形成是CEUS的基礎(chǔ)，時間-強(qiáng)度曲線的AUC反映造影劑進(jìn)入ROI的總體情況，代表病變內(nèi)ROI的平均血流量，能夠反映腫瘤微循環(huán)灌注情況。因此，PTC結(jié)節(jié)不同部位的MVD和相應(yīng)部位的CEUS定量參數(shù)能夠更準(zhǔn)確地反映腫瘤真實微循環(huán)情況，結(jié)節(jié)周邊區(qū)時間-強(qiáng)度曲線的AUC與結(jié)節(jié)周邊MVD具有相關(guān)性。

總之，CEUS定量分析對評估PTC的侵襲性具有重要價值；病理MVD可為評價PTC的侵襲性提供病理學(xué)依據(jù)。

(致謝：衷心感謝Tissue Gnostics China Division提供的全景組織細(xì)胞定量分析系統(tǒng)對課題的支持，誠摯感謝莊新品博士在微血管密度MVD計數(shù)中對課題的幫助。)