張惠麗 李如堯 馬燕 趙信燕

(定西市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，甘肅 定西 743000)

在全球范圍內(nèi)，肺癌是腫瘤致死的重要原因，其具有發(fā)病率高、惡性程度高等特點，隨著治療技術(shù)的不斷進步，肺癌的治療和診斷雖然取得了巨大進展，但仍然不能滿足需求，非小細胞肺癌是肺癌分型中的一種，占全部肺癌患者的85%左右〔1,2〕。靶向基因治療是近年來腫瘤治療的熱點，其具有準(zhǔn)確性高、安全等多種優(yōu)點，尋找有效的靶基因是目前醫(yī)學(xué)工作者的難點。鋅指蛋白(ZNF)217屬于鋅指蛋白家族，在很多惡性腫瘤中高表達，如胃癌、乳腺癌、肺癌等，ZNF217沉默可以抑制乳腺癌、肝癌等腫瘤細胞的生長，在腫瘤發(fā)展中發(fā)揮癌基因的作用〔3～7〕。本研究通過Realtime PCR和Western印跡檢測ZNF217在非小細胞肺癌細胞和正常人肺上皮細胞中的表達，并通過短發(fā)夾RNA(shRNA)干擾非小細胞肺癌細胞中ZNF217的表達水平，探討沉默ZNF217對非小細胞肺癌細胞增殖、克隆等生物學(xué)特性的影響，為尋找有效的靶基因治療非小細胞肺癌提供思路。

1 材料與方法

1.1主要材料 聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific；胎牛血清購自美國Gibco；引物由上海英駿公司合成；細胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體、p21抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體均購自美國Abcam；shRNA-ZNF217慢病毒干擾載體由漢恒生物技術(shù)(上海)有限公司構(gòu)建；cDNA合成試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；SYBR Green Real-time PCR試劑盒購自上海索萊寶生物科技有限公司。

1.2細胞株 人非小細胞肺癌細胞A549、H1299、SW1573和正常人肺上皮細胞BEAS-2B均培養(yǎng)于含有10%胎牛血清(FBS)、100 U/ml青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，細胞均置于37℃，體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)3 d以后，顯微鏡下觀察細胞匯合度為90%左右，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。人非小細胞肺癌細胞A549、H1299、SW1573和正常人肺上皮細胞BEAS-2B均購自美國ATCC。

1.3Realtime PCR檢測ZNF217在非小細胞肺癌細胞中的表達 人非小細胞肺癌細胞A549、H1299、SW1573和正常人肺上皮細胞BEAS-2B經(jīng)0.25%的胰蛋白酶消化以后，添加TRIZOL裂解液，置于冰上充分裂解以后，添加200 μl的氯仿，劇烈震蕩以后，置于室溫中孵育3 min，12 000 r/min離心10 min后，吸取上層水相至離心管中，添加500 μl的異丙醇溶液混合后將RNA沉淀，用75%乙醇溶液洗滌RNA后，晾干，用DEPC水溶解后，保存在-80℃。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，用SYBR Green Real-time PCR試劑盒檢測ZNF217水平。ZNF217正向引物5'-AAACATGCCAACTCAATCCCTC-3'，反向引物5'-GGAATGGAACAACAGCGGT-3'。β-actin正向引物5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'，反向引物5'-GCTCTCACCTTCACCGTTCC-3'。

1.4Western印跡測定ZNF217在非小細胞肺癌細胞中的表達 取人非小細胞肺癌細胞A549、H1299、SW1573和正常人肺上皮細胞BEAS-2B，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，將PBS吸凈，添加適量的裂解液，放在冰上裂解30 min以后，14 000 r/min，4℃離心10 min。以BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。常規(guī)方法配制5%的濃縮膠和10%的分離膠，在電泳裝置中加入電泳液，上樣孔中加入30 μg蛋白樣品，80 V的電壓電泳，等到蛋白在積層膠中成為一條直線以后，改為100 V電壓繼續(xù)電泳。觀察染料進入凝膠下端的1 cm處時，結(jié)束電泳。把凝膠上的蛋白在4℃環(huán)境中轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。PVDF膜經(jīng)過5%牛血清白蛋白封閉(室溫封閉60 min)后，再與一抗和二抗孵育。一抗稀釋倍數(shù)為1∶800，二抗稀釋倍數(shù)為1∶1 000。按照ECL顯色試劑盒顯色以后，用凝膠成像分析儀采集圖片以后，分析各條帶灰度值。ZNF217蛋白表達水平=ZNF217蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.5細胞分組 慢病毒感染：H1299細胞密度為40%時，將上清吸除，添加病毒液，病毒感染復(fù)數(shù)為20，培養(yǎng)12 h以后，把病毒液棄掉，加入細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 d，熒光顯微鏡下觀察感染效率高于85%，用嘌呤霉素篩選抗性細胞用于后續(xù)實驗研究。感染shRNA-ZNF217慢病毒干擾載體的細胞計為干擾組，同時將感染對照慢病毒載體的細胞作為陰性對照組，把沒有感染的細胞作為空白對照組。

1.6MTT測定細胞增殖 空白對照組、陰性對照組、干擾組細胞按照96孔板每孔添加100 μl細胞懸液接種，每個孔內(nèi)加入4 000個細胞，在培養(yǎng)48 h以后，在每個孔內(nèi)加入20 μl的MTT工作液，繼續(xù)放在37℃中孵育4 h。把孔內(nèi)的液體吸棄，在每個孔內(nèi)加入150 μl的二甲基亞砜，觀察結(jié)晶物溶解以后，檢測490 nm的OD值，經(jīng)空白孔調(diào)零以后，計算細胞增殖率變化，空白對照組增殖率為100%。

1.7平板克隆實驗檢測細胞克隆能力 空白對照組、陰性對照組、干擾組細胞以0.25%的胰蛋白酶消化以后，用細胞培養(yǎng)液將細胞密度調(diào)整為1 000個細胞/ml，接種到6孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)約10 d后，以甲醇溶液固定以后，用0.25%的結(jié)晶紫染色，觀察細胞數(shù)目大于50的克隆數(shù)目，以克隆數(shù)目占接種細胞數(shù)目的百分比表示克隆形成率。

1.8流式細胞術(shù)檢測細胞周期 空白對照組、陰性對照組、干擾組細胞以0.25%胰蛋白酶消化以后，用75%的乙醇溶液將細胞懸浮以后，放在4℃結(jié)合1 h，1 000 r/min離心10 min，把上清溶液棄掉，添加PBS將細胞重懸。再添加50 μg/ml的碘化丙啶(PI)染液300 μl，于4℃避光染色30 min。流式細胞儀測定細胞周期的變化情況。

1.9流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 空白對照組、陰性對照組、干擾組細胞用0.25%的胰蛋白酶消化后，收集細胞，添加200 μl結(jié)合緩沖液把細胞懸浮以后，再添加PI和Annexin V-FITC，加入200 μl的緩沖液，立即用流式細胞儀檢測細胞凋亡變化。

1.10Western印跡檢測p21、Cyclin D1、Bax蛋白表達 空白對照組、陰性對照組、干擾組細胞用0.25%的胰蛋白酶消化后，收集細胞，用Western印跡方法檢測細胞中p21、Cyclin D1、Bax蛋白水平，步驟同1.4。p21抗體以1∶600稀釋，Cyclin D1抗體以1∶800稀釋，Bax抗體以1∶400稀釋。

1.11統(tǒng)計分析 經(jīng)SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1ZNF217在人非小細胞肺癌細胞中高表達 人非小細胞肺癌細胞A549、H1299、SW1573和正常人肺上皮細胞BEAS-2B中ZNF217 mRNA和蛋白水平明顯高于正常人肺上皮細胞BEAS-2B(P<0.05)。并且H1299細胞中ZNF217 mRNA和蛋白水平明顯高于A549和SW1573細胞(均P<0.05)。選用H1299繼續(xù)做后續(xù)實驗，見圖1和表1。

2.2shRNA-ZNF217下調(diào)非小細胞肺癌細胞中ZNF217的表達水平 shRNA-ZNF217慢病毒干擾載體感染后的H1299細胞中ZNF217 mRNA和蛋白水平明顯降低(P<0.05)，見圖2和表2。shRNA-ZNF217慢病毒干擾載體下調(diào)H1299細胞中ZNF217 的表達。

1～4：BEAS-2B細胞，SW1573細胞，H1299細胞，A549細胞圖1 Western印跡檢測人非小細胞肺癌細胞和正常肺上皮細胞中ZNF217蛋白水平

細胞ZNF217 mRNAZNF217 蛋白BEAS-2B1.00±0.000.15±0.02SW15731.68±0.121)0.24±0.051)H12992.85±0.171)2)3)0.42±0.031)2)3)A5492.14±0.131)2)0.35±0.031)2)

與BEAS-2B比較:1)P<0.05；與SW1573比較:2)P<0.05；與A549比較:3)P<0.05

圖2 Western印跡檢測慢病毒感染后細胞中ZNF217表達水平

組別ZNF217 mRNAZNF217 蛋白空白對照組1.00±0.000.40±0.06陰性對照組0.99±0.130.41±0.04干擾組0.43±0.031)0.19±0.031)

與空白對照組和陰性對照組比較：1)P<0.05，下表同

2.3ZNF217沉默降低非小細胞肺癌細胞增殖和克隆能力 沉默ZNF217后的非小細胞肺癌細胞的增殖率和克隆形成率均明顯低于空白對照組和陰性對照(均P<0.05)，見表3。沉默ZNF217降低非小細胞肺癌細胞增殖和克隆形成能力。

表3 沉默ZNF217后細胞增殖率和克隆形成率

2.4ZNF217沉默對非小細胞肺癌細胞周期的影響 沉默ZNF217后的非小細胞肺癌細胞G1比例明顯升高，S期比例明顯降低，同時細胞中周期蛋白Cyclin D1表達水平明顯降低，p21表達水平明顯升高，見圖3和表4。沉默ZNF217將非小細胞肺癌細胞阻滯在G1期，阻礙細胞從G1期向S期過渡。

圖3 Western印跡檢測沉默ZNF217后的非小細胞肺癌細胞中p21、Cyclin D1蛋白水平

組別G1(%) S(%)G2/M(%)Cyclin D1p21空白對照組56.23±4.1221.45±2.1722.32±1.740.82±0.090.36±0.08陰性對照組54.71±6.3822.92±2.5822.37±2.560.80±0.060.38±0.05干擾組71.23±7.211)8.25±1.051)20.52±2.450.35±0.031)0.76±0.081)

2.5ZNF217沉默促進非小細胞肺癌細胞凋亡 沉默ZNF217后的非小細胞肺癌細胞凋亡率明顯升高，細胞中凋亡蛋白Bax水平也明顯升高，見圖4和表5。沉默ZNF217誘導(dǎo)非小細胞肺癌細胞凋亡。

圖4 Western印跡檢測非小細胞肺癌細胞中凋亡蛋白Bax表達變化

組別凋亡率(%)Bax空白對照組2.25±0.230.28±0.03陰性對照組2.98±0.310.27±0.06干擾組18.56±1.471)0.74±0.061)

3 討 論

ZNF217存在于多種腫瘤基因復(fù)制活躍的20q13.2染色體上，其蛋白的N端含有2簇7個經(jīng)典的鋅指結(jié)構(gòu)，其中1簇中的第6和第7個鋅指結(jié)構(gòu)能夠特異性的同DNA雙鏈結(jié)合，另外，ZNF217還能夠與組蛋白修飾蛋白、共受體蛋白等結(jié)合，參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄受體復(fù)合物的形成〔8,9〕。ZNF217是一個潛在的癌基因，能夠調(diào)控多種腫瘤細胞生物學(xué)特性，其在乳腺癌、肝癌、膠質(zhì)瘤等腫瘤中表達上調(diào)〔7,8,10〕。目前在膠質(zhì)瘤、卵巢癌等細胞中均已發(fā)現(xiàn)，沉默ZNF217具有抑制腫瘤細胞生長，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用〔11～13〕。ZNF217在非小細胞肺癌組織中的表達水平遠遠高于對應(yīng)的癌旁組織，并且其表達水平的高低與腫瘤患者生存率負相關(guān)〔5〕。本實驗結(jié)果表明，ZNF217在3株非小細胞肺癌細胞中的表達水平均高于正常肺上皮細胞，提示ZNF217在非小細胞肺癌中高表達。腫瘤細胞的惡性增殖與腫瘤細胞周期進展密切相關(guān)，其中G1期向S期進展是細胞周期中的重要檢查點，需要多種因子的共同調(diào)控作用〔14,15〕。Cyclins蛋白家族在特定的細胞周期被激活，其中Cyclin D1作為Cyclins家族的成員之一可以促進細胞從G1期進入S期，其在G1期表達水平上調(diào)〔16〕。細胞周期蛋白活性的高低與細胞中周期抑制因子的表達水平有關(guān)，其中p21能夠抑制G1期Cyclin D1的活性，阻礙細胞從G1期向S期進展〔17～19〕。之前的研究顯示，ZNF217可以促進肝癌細胞從G1期向S期進展，從而發(fā)揮促進肝癌細胞生長的作用〔7〕。本實驗的結(jié)果顯示，沉默ZNF217后的肝癌細胞發(fā)生G1期阻滯，同時細胞中Cyclin D1蛋白水平降低，p21蛋白水平升高，說明沉默ZNF217可以通過調(diào)控細胞周期相關(guān)因子阻滯非小細胞肺癌細胞周期，從而發(fā)揮細胞增殖抑制的作用。

癌細胞惡性增殖的同時常常伴隨有細胞凋亡異常減少等現(xiàn)象，細胞凋亡同細胞死亡不同，是受到細胞內(nèi)多種基因調(diào)控的結(jié)果〔20～22〕。Bax是細胞凋亡促進因子，其屬于Bcl-2蛋白家族的成員，在細胞凋亡發(fā)生時高表達，Bax也是細胞凋亡發(fā)生的標(biāo)志蛋白〔23～25〕。研究顯示，沉默ZNF217誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤等腫瘤細胞凋亡的同時促進細胞中Bax的表達〔11〕。本實驗的結(jié)果顯示，沉默ZNF217后非小細胞肺癌細胞中Bax的蛋白水平升高，同時細胞凋亡率也升高，提示沉默ZNF217可以誘導(dǎo)非小細胞肺癌細胞凋亡。以上表明，ZNF217作為一種癌基因，在非小細胞肺癌細胞中高表達，沉默其表達可以通過誘導(dǎo)細胞凋亡、阻滯細胞周期，發(fā)揮抑非小細胞肺癌細胞生長的作用，靶向ZNF217可能是治療非小細胞肺癌的途徑之一，ZNF217在腫瘤發(fā)生中的機制尚不明確，在以后的實驗中會對其作用機制進行深入探討。