遲乃玉，劉 洋，于 爽，希 倫，李美玉，張慶芳*

（1.大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116622）

肌氨酸氧化酶（sarcosine oxidase，SOX）EC.1.5.3.1是酶法測(cè)定肌酐中的關(guān)鍵酶，可催化肌氨酸中的N-甲基的氧化還原，可偶聯(lián)肌酐酶和肌酸酶將肌酐降解[1-3]。作為測(cè)定血清或尿液中肌酐含量的關(guān)鍵酶之一，被用于診斷腎臟的健康程度[4-6]。為了滿足工業(yè)用酶的需求，研究學(xué)者們從肌氨酸氧化酶的分布、酶學(xué)性質(zhì)以及分子生物學(xué)方面進(jìn)行了大量研究[7-10]。MORI N等[7]研究發(fā)現(xiàn)，真菌Cylindrocarpon didymiumM-1可產(chǎn)單聚體SOX，測(cè)得該酶分子質(zhì)量為48 kDa，最適pH值為7.5，最適溫度為40℃。劉輝等[8]從菜園土壤中篩選出一株芽孢桿菌（Bacillussp.）BSD-8，純化后的酶在十二烷基硫酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）中均顯示單一條帶，為單聚體SOX，分子質(zhì)量為51 kDa，米氏常數(shù)（Km）值為3.1 mmol/L，最適合pH 8.5，在7.0～10.0之間穩(wěn)定，最適溫度為60℃，60℃處理10 min，仍有94%的酶活，是目前熱穩(wěn)定性最好的。SUZUKI N等[9]從棒狀桿菌Corynebacteriumsp.U-96中獲得由四個(gè)亞基組成的SOX，亞基大小分別為10 kDa、21 kDa、44 kDa、110 kDa，酶的米氏常數(shù)（Km）值為3.8 mmol/L，最適pH 8.3，最適溫度37℃，在45℃處理10 min，酶完全失活。KIM J M等[10]篩選到1株反硝化產(chǎn)堿菌（Alcaligenes denitrificans），SDS-PAGE有兩條條帶，分別為55 kDa、100 kDa，最適pH 8.0，最適溫度為37℃，30℃以下穩(wěn)定，酶的米氏常數(shù)（Km）值為4.2 mmol/L。

在臨床試驗(yàn)中，血清肌酐濃度是判斷腎功能的重要指標(biāo)。目前肌酐的測(cè)定通常用Jaffé法測(cè)定[11]。該方法是基于化學(xué)反應(yīng)基礎(chǔ)上的，特異性較差，血清中許多化學(xué)物質(zhì)會(huì)干擾測(cè)定結(jié)果，這使得疾病的診斷變得困難[12]。由于酶催化反應(yīng)具有比一般化學(xué)反應(yīng)更高的特異性，開(kāi)發(fā)出酶促肌酐的測(cè)定方法為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[13-15]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)海洋來(lái)源的產(chǎn)肌氨酸氧化酶的芽孢桿菌（Bacillussp.）LYH18進(jìn)行研究，對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，并采用十二烷基硫酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）對(duì)該酶進(jìn)行分離純化，分析其分子質(zhì)量，以期為肌氨酸氧化酶工業(yè)化生產(chǎn)、酶法制備肌氨酸氧化酶工藝以及肌氨酸氧化酶法檢測(cè)肌酐試劑盒的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

芽孢桿菌（Bacillussp.）LYH18：分離自遼寧省大連渤海灣海域的海泥海水樣品，現(xiàn)由大連大學(xué)生物工程學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.3 化學(xué)試劑

肌酸（分析純）：大連凱美化工有限公司；蛋白Marker：加拿大Fermentas公司；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒：北京TIANGEN生物公司；葡聚糖凝膠G-75：北京索萊寶科技有限公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

固體LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，瓊脂2%，NaCl 1%，水1 L；pH 7.0。

種子培養(yǎng)基：肌酸，5.0 g；酵母膏，0.5 g；硫酸鎂，0.5 g；磷酸氫二鉀，0.5 g；磷酸二氫鉀，2 g；海水1 L；pH 7.0。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：肌酸，8.0 g；酵母膏，5.0 g；硫酸鎂，0.5 g；磷酸氫二鉀，0.5 g；磷酸二氫鉀，2 g；海水1 L；pH 7.0。

以上培養(yǎng)基均在0.1MPa、121℃高壓蒸汽滅菌20min[16]。

1.2 儀器與設(shè)備

LDFX-50BI立式壓力蒸汽滅菌鍋、GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)、HZP-256全溫振蕩培養(yǎng)箱：蘭州方盛生物科技有限公司；CX21FS3顯微鏡：日本OLYMPUS公司；P3031移液器：美國(guó)吉而遜實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；APL-204電子天平、pH-3G pH計(jì)：陜西鼎盛儀器公司；DYY-6C電泳儀：北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

菌株活化：在無(wú)菌條件下，將芽孢桿菌LYH18接種到固體LB培養(yǎng)基中并在25℃靜置培養(yǎng)24 h，三區(qū)劃線進(jìn)行分離純化，4℃條件下儲(chǔ)存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

種子培養(yǎng)：在無(wú)菌條件下，用接種環(huán)挑取一環(huán)菌體，接種于裝液量為100 mL/250 mL的種子培養(yǎng)基中，25℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：在無(wú)菌條件下，將上述種子液按1%的量接種于裝液量200 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h。

1.3.2 肌氨酸氧化酶粗酶液制備

將通過(guò)最適發(fā)酵條件培養(yǎng)的發(fā)酵液，4℃條件下8 000 r/min離心15 min，收集菌體，用50 mmol/L，pH 7.4的磷酸緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）進(jìn)行吹打沖洗后離心，重復(fù)3次，再將其懸浮于兩倍體積的緩沖液中。通過(guò)超聲波200 W破3 s停3 s條件下將細(xì)胞破碎，4℃條件下12 000 r/min離心30 min，取上清，得到粗酶液。

1.3.3 肌氨酸氧化酶酶活測(cè)定方法[17-19]

將粗酶液0.1 mL加入到0.9 mL的焦磷酸鈉緩沖液（含0.1 mol/L肌氨酸）中，于37℃反應(yīng)10 min，再加入0.25 mL 0.1 mol/L的醋酸終止反應(yīng)，加入1.5 mL 20%的乙酸銨溶液（含0.04%乙酰丙酮），于37℃反應(yīng)40 min后，在波長(zhǎng)410 nm處測(cè)吸光度值（OD410nm值）。

產(chǎn)肌氨酸氧化酶酶活定義：37℃每分鐘分解1 μmol肌氨酸的酶量為一個(gè)酶活單位（U）。

1.3.4 產(chǎn)酶曲線和生長(zhǎng)曲線測(cè)定

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，接入1%的菌液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。無(wú)菌條件下，在不同時(shí)間（0～120 h），對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行取樣，0～60 h，每隔4 h測(cè)OD410nm，60～120 h，每隔12 h測(cè)OD410nm值，計(jì)算酶活，繪制時(shí)間-酶活曲線；0～12h，每隔3h測(cè)OD600nm值，12～60 h，每隔6 h測(cè)OD600nm值，60～120 h，每隔12 h測(cè)OD600nm值，繪制菌株生長(zhǎng)曲線。

1.3.5 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

（1）誘導(dǎo)物對(duì)菌株LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入1%不同誘導(dǎo)物（肌酸、肌酐、肌氨酸、氯化膽堿、不加誘導(dǎo)物的為空白對(duì)照組），接種1%的菌液在25℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)72 h。測(cè)定粗酶液酶活。相對(duì)酶活：以該組最大酶活為100%，其他酶活占其百分比為相對(duì)酶活，下同。

（2）不同碳源對(duì)菌株LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入1%不同種類的碳源（肌酸、果糖、檸檬酸鈉、乙酸鈉、乳糖、葡萄糖），接種1%的菌液在25℃、150r/min條件下振蕩培養(yǎng)48h，測(cè)定粗酶液酶活。

（3）碳源添加量對(duì)菌株LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入1%不同濃度（0.25%～1.50%，梯度為0.25%）的肌酸，接種1%的菌液在25℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)72 h，測(cè)定粗酶液酶活。

（4）不同氮源對(duì)菌株LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入1%不同種類氮源（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、玉米漿、明膠、酪蛋白），接種1%的菌液在25℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)72 h，測(cè)定酶活。

（5）氮源添加量對(duì)菌株LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入1%不同濃度的最優(yōu)氮源（0.4%～2.0%，梯度為0.4%），接種1%的菌液在25℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)72 h，測(cè)定酶活。

（6）無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基中的KH2PO4、MgSO4·7H2O、K2HPO4添加量分別設(shè)為0.030%～0.060%，梯度為0.010%，25℃、150r/min條件下振蕩培養(yǎng)72 h，測(cè)定粗酶液酶活。

（7）初始pH對(duì)菌株芽孢桿菌LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響

用酸堿指示劑調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基至不同的初始pH值（pH 5～10，梯度為0.5），25℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)72h，測(cè)定粗酶液酶活。

（8）培養(yǎng)溫度對(duì)菌株LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基置于不同溫度下（15～35℃，梯度為5℃），25℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)72 h，測(cè)定粗酶液酶活。

（9）裝液量對(duì)菌株LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響

設(shè)置不同裝液量（10mL/100 mL～40 mL/100 mL梯度為10 mL，60 mL/100 mL），按1%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，測(cè)定粗酶液酶活。

1.3.6 酶的分離純化

硫酸銨沉淀：向1.3.2節(jié)中制備的粗酶液中緩慢加入硫酸銨，使溶液中硫酸銨飽和度達(dá)到20%，4℃靜置過(guò)夜后，在4℃、8000r/min條件下離心10min，取上清液，備用。在上清液中繼續(xù)加入硫酸銨，使其飽和度達(dá)到80%，4℃靜置過(guò)夜后8 000 r/min條件下冷凍離心10 min，棄去上清，將沉淀重懸于50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（pH 7.4），將經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀后的酶液裝入透析袋中，用pH 7.4的PBS緩沖液作為交換液進(jìn)行透析，每隔12 h進(jìn)行更換一次緩沖液，至無(wú)SO42-為止。將透析后的樣品加入超濾管，4℃、8 000 r/min條件下離心10 min后保留上清液，備用。

Sephadex G-75凝膠過(guò)濾層析：取6 mL透析后的樣品加入用PBS（pH 7.4）緩沖液預(yù)平衡的Sephadex G-75凝膠過(guò)濾層析柱。在0.1MPa柱壓、流速0.5mL/min條件下，用3倍柱床體積的PBS緩沖液（pH 7.4）洗脫后，再用含0～1 mol/L氯化鈉的PBS緩沖液（pH 7.4）進(jìn)行線性梯度洗脫，體積流量為1 mL/min，每管收集6 mL，測(cè)定每個(gè)收集管肌氨酸氧化酶活力和總蛋白含量。在波長(zhǎng)280 nm處的紫外光下檢測(cè)樣品。在線測(cè)定酶活后，收集合并有酶活洗脫液。

1.3.7 酶的純度及分子質(zhì)量測(cè)定

通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定肌氨酸氧化酶的分子質(zhì)量，標(biāo)準(zhǔn)蛋白為兔磷酸化酶B（97.4 kDa）、牛血清白蛋白（66.2 kDa）、兔肌動(dòng)蛋白（43.0 kDa）、牛碳酸酐酶（31.0 kDa）、胰蛋白酶抑制劑（20.1 kDa）、雞蛋清溶菌酶（14.4 kDa）。采用12%的分離膠、5%的濃縮膠，電泳2 h結(jié)束后，用R250染色液漫過(guò)膠，置于搖床，25℃、45 r/min條件下染色1 h，后加脫色液于脫色搖床25℃、45 r/min條件下脫色12 h，期間每3 h更換一次脫色液。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線

由圖1生長(zhǎng)曲線可知，芽孢桿菌LYH18在0～18 h隨時(shí)間的延長(zhǎng)生長(zhǎng)量急劇增加，說(shuō)明該菌適應(yīng)性很強(qiáng)，遲滯期很短甚至沒(méi)有，0～18 h為其生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期；18～50 h生長(zhǎng)量穩(wěn)定，為穩(wěn)定期，此期細(xì)菌增殖數(shù)與死亡數(shù)幾乎相等，芽孢和大多數(shù)酶亦多在此期形成；50 h后生長(zhǎng)量降低，進(jìn)入衰退期，72 h之后該菌幾乎停滯生長(zhǎng)。

圖1 芽孢桿菌LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶與生長(zhǎng)曲線Fig.1 Sarcosine oxidase production and growth curve of BacillusLYH18

由圖1產(chǎn)酶曲線可知，該菌株在0～30 h，粗酶液酶活極低，基本為零，因該酶為滯后合成酶，在生長(zhǎng)的前期并不產(chǎn)酶；36～84 h酶活隨時(shí)間增長(zhǎng)而增高，說(shuō)明36 h后即穩(wěn)定期后期，該菌開(kāi)始產(chǎn)SOX；在84 h時(shí)達(dá)到最大值，為1.65 U/mL；在84 h后酶活逐漸降低；該菌在72 h時(shí)酶活較高，十分接近最大值，結(jié)合生長(zhǎng)曲線特性，設(shè)定發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為72 h。

2.2 發(fā)酵條件單因素優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 誘導(dǎo)物對(duì)芽孢桿菌LYH18產(chǎn)酶的影響

SOX是一種誘導(dǎo)酶，在發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)必須加入一定量的誘導(dǎo)物。不同誘導(dǎo)物對(duì)芽孢桿菌產(chǎn)酶的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同誘導(dǎo)物對(duì)菌株芽孢桿菌LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響Fig.2 Effect of different inducers on sarcosine oxidase production by BacillusLYH18

由圖2可知，肌酸對(duì)酶的誘導(dǎo)作用最強(qiáng)，其次為肌酐，依次為肌酸＞肌酐＞肌氨酸＞氯化膽堿，因此，選用肌酸作為發(fā)酵誘導(dǎo)物。進(jìn)一步查閱氯化膽堿相關(guān)資料可知，其雖然可誘導(dǎo)該菌株合成SOX，但并不是SOX底物，不能被SOX分解[20]。

2.2.2 不同碳源對(duì)芽孢桿菌LYH18產(chǎn)酶的影響

在培養(yǎng)基中加入1%的不同碳源進(jìn)行發(fā)酵，并測(cè)定酶活性，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，肌酸、乙酸鈉、葡萄糖對(duì)菌株產(chǎn)酶活性有促進(jìn)作用，其中肌酸＞乙酸鈉＞葡萄糖；肌酸的促進(jìn)作用十分顯著，在加入1%的肌酸后，SOX活性比對(duì)照組顯著提高；而果糖、檸檬酸鈉、乳糖則對(duì)菌株產(chǎn)酶有抑制作用，抑制作用大小為檸檬酸鈉＞乳糖＞果糖。因此，肌酸可作為誘導(dǎo)物且為唯一碳源。

圖3 不同碳源對(duì)菌株芽孢桿菌LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響Fig.3 Effect of different carbon sources on sarcosine oxidase production byBacillusLYH18

2.2.3 肌酸加入量對(duì)芽孢桿菌LYH18產(chǎn)酶的影響

在培養(yǎng)基中加入不同濃度的肌酸進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定其酶活性，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，在較低濃度下，肌酸對(duì)酶的產(chǎn)生具有顯著影響。隨著肌酸的添加，酶的產(chǎn)生能力增加，至肌酸添加量為1%時(shí)達(dá)到最大值，肌酸添加量＞1.0%之后，對(duì)菌株產(chǎn)酶能力有抑制作用。因此，選擇最適肌酸添加量為1.0%。

圖4 不同肌酸添加量對(duì)菌株芽孢桿菌LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響Fig.4 Effect of different creatine addition on sarcosine oxidase production byBacillusLYH18

2.2.4 不同氮源對(duì)芽孢桿菌LYH18產(chǎn)酶的影響

在培養(yǎng)基中加入1%的牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、玉米漿、明膠、酪蛋白作為微生物的補(bǔ)充氮源進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，粗酶液酶活測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知在所測(cè)定的氮源中，酵母膏和玉米漿對(duì)該菌株產(chǎn)SOX有較大促進(jìn)作用，酵母膏的促進(jìn)作用尤其明顯。因此，選擇酵母膏作為該菌產(chǎn)酶的最適氮源[21]。酵母類有機(jī)氮源中蛋白質(zhì)含量高（蛋白質(zhì)占干菌體總質(zhì)量50%以上），含有18種氨基酸，種類齊全，維生素和礦物質(zhì)等含量豐富，是微生物菌體培養(yǎng)與產(chǎn)物發(fā)酵的優(yōu)質(zhì)有機(jī)氮源[22]。

圖5 不同氮源對(duì)菌株芽孢桿菌LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響Fig.5 Effects of different nitrogen sources on the sarcosine oxidase production byBacillusLYH18

2.2.5 酵母膏添加量對(duì)芽孢桿菌LYH18產(chǎn)酶的影響

以酵母膏為最優(yōu)氮源，在培養(yǎng)基中加入不同量的酵母膏，粗酶液酶活測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，當(dāng)酵母膏添加量為0.8%時(shí)，酶活最高；添加量1.0%、1.2%時(shí)，相對(duì)酶活均在60%以上；添加量為0.4%、2.0%時(shí)，相對(duì)酶活不足60%，酵母膏添加量過(guò)高或過(guò)低均不利于發(fā)酵產(chǎn)酶。因此，選擇最適酵母膏添加量為0.8%。

圖6 不同酵母膏添加量對(duì)菌株芽孢桿菌LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響Fig.6 Effect of different yeast extracts addition on sarcosine oxidase production byBacillusLYH18

2.2.6 無(wú)機(jī)鹽最適添加量對(duì)菌株LYH18發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

由表1可知，無(wú)機(jī)鹽K2HPO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶均有一定的影響。且當(dāng)K2HPO4添加量為0.05%時(shí)，肌氨酸氧化酶相對(duì)酶活最高；MgSO4·7H2O添加量為0.05%時(shí)，肌氨酸氧化酶相對(duì)酶活最高，而當(dāng)MgSO4·7H2O添加量＞0.05%時(shí)，相對(duì)酶活逐漸降低；KH2PO4添加量為0.05%時(shí)，相對(duì)酶活最高，且濃度過(guò)高或過(guò)低均不利于產(chǎn)酶，分析原因可能無(wú)機(jī)鹽的過(guò)量缺乏或累積均會(huì)抑制產(chǎn)酶。因此，確定各種無(wú)機(jī)鹽最時(shí)添加量為K2HPO40.05%、MgSO4·7H2O 0.05%、KH2PO40.20%。

表1 無(wú)機(jī)鹽添加量對(duì)芽孢桿菌LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響Table 1 Effect of inorganic salt addition on sarcosine oxidaseproduction byBacillusLYH18

2.2.7 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)菌株LYH18產(chǎn)酶的影響

酶的本質(zhì)是一種蛋白質(zhì)，酶不能夠在過(guò)酸或過(guò)堿條件下具有較高活性甚至?xí)セ钚訹23]。為研究該菌株產(chǎn)SOX的最適起始pH，以0.5為梯度，在pH 5～10之間選擇了11個(gè)pH值，測(cè)定粗酶液酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知，初始pH值在5.5～7.0之間，酶活隨初始pH值增加而增加，初始pH值7.0時(shí)酶活達(dá)到最大值；初始pH值在7.5～10.0之間時(shí)，酶活隨著pH值增加而降低；初始pH值＜5.5及＞8.5時(shí)，酶活極低，趨近于零，說(shuō)明酸堿環(huán)境對(duì)該菌株產(chǎn)酶均有明顯抑制作用。因此，確定該菌株的最適產(chǎn)酶初始pH值為7.0。

圖7 培養(yǎng)基起始pH值對(duì)芽孢桿菌LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響Fig.7 Effect of initial pH of medium on sarcosine oxidase production byBacillusLYH18

2.2.8 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株芽孢桿菌LYH18產(chǎn)酶的影響

一般而言，溫度越高，化學(xué)反應(yīng)速率越快，在一定溫度范圍內(nèi)，酶的催化作用也是如此。但酶的本質(zhì)是一種蛋白質(zhì)，溫度太高可以使其發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的變性，使其失去酶的催化活性[24]。為研究該菌株產(chǎn)SOX的最適溫度，將發(fā)酵溫度分別控制在（15～35℃，梯度為5℃），發(fā)酵培養(yǎng)72 h后，測(cè)定酶活，結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖8可知，溫度在15～25℃時(shí)，酶活力隨著溫度升高而升高；當(dāng)溫度為25℃時(shí)，酶活力達(dá)到最大值0.45 U/mL；當(dāng)溫度高于25℃之后，酶活力呈下降趨勢(shì)，酶活在20～30℃能保持75%以上相對(duì)酶活。因此，確定該菌株發(fā)酵最適溫度為25℃。

圖8 不同培養(yǎng)溫度對(duì)芽孢桿菌LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響Fig.8 Effect of different culture temperature on sarcosine oxidase production byBacillusLYH18

2.2.9 裝液量對(duì)菌株芽孢桿菌LYH18產(chǎn)酶的影響

考察裝液量對(duì)菌株芽孢桿菌LYH18產(chǎn)酶的影響，測(cè)定酶活及生長(zhǎng)量，結(jié)果見(jiàn)圖9。由圖9可知，當(dāng)培養(yǎng)基裝液量從10 mL/100 mL增加至40 mL/100 mL時(shí)，產(chǎn)酶能力增加了2倍以上，繼續(xù)提高裝液量后，產(chǎn)酶能力迅速降低，分析原因可能是該菌株為好氧菌，較少通氣量有利于菌株產(chǎn)酶，但當(dāng)氧氣供應(yīng)太少會(huì)嚴(yán)重影響菌體生長(zhǎng)，而最終影響酶的產(chǎn)生[23-24]。因此，最適裝液量為40 mL/100 mL。

圖9 通氣量對(duì)芽孢桿菌LYH18產(chǎn)肌氨酸氧化酶的影響Fig.9 Effect of ventilation on sarcosine oxidase production by BacillusLYH18

2.3 肌氨酸氧化酶的分離純化

2.3.1 硫酸銨分級(jí)沉淀

硫酸銨沉淀法可用于從大量粗制劑中濃縮和純化蛋白，利用此法可從粗酶液中分離出較純的SOX酶液，結(jié)果見(jiàn)圖10。由圖10可知，當(dāng)硫酸銨鹽飽和度為50%時(shí)，開(kāi)始可以檢測(cè)出SOX活性，隨著硫酸銨鹽飽和度的增加，酶活性不斷增加，當(dāng)硫酸銨鹽飽和度達(dá)到70%時(shí)，活性最高，因此，確定SOX在硫酸銨鹽飽和度為50%～70%時(shí)沉淀下來(lái)。

圖10 硫酸銨對(duì)肌氨酸氧化酶的分級(jí)沉淀Fig.10 Fractionation precipitation of sarcosine oxidase by ammonium sulfate

2.3.2 凝膠過(guò)濾層析

將硫酸銨鹽析純化后的酶液經(jīng)Sephadex G-75凝膠柱層析后，洗脫曲線見(jiàn)圖11。由圖11可知，出現(xiàn)7個(gè)吸收峰，每個(gè)吸收峰代表一種蛋白，說(shuō)明分離出7種蛋白，對(duì)7種蛋白的收集管分別測(cè)定酶活，結(jié)果可知，僅有37號(hào)～56號(hào)管的收集液中有SOX活性。

圖11 硫酸銨沉淀后肌氨酸氧化酶經(jīng)Sephadex G-75凝膠過(guò)濾層析結(jié)果Fig.11 Sephadex G-75 gel filtration chromatography results of sarcosine oxidase after ammonium sulfate precipitation

2.3.3 SDS-PAGE電泳

純化后的肌氨酸氧化酶的SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖12。由圖12可知，所得純化SOX顯示為一個(gè)單一的條帶，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白的比較計(jì)算，表示得到了芽孢桿菌LYH18所產(chǎn)電泳純、分子質(zhì)量為43 kDa的肌氨酸氧化酶。

圖12 純化后肌氨酸氧化酶的SDS-PAGE電泳圖Fig.12 SDS-PAGE electrophoretogram of purified sarcosine oxidase

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選擇的海洋來(lái)源的芽孢桿菌（Bacillussp.）LYH18為革蘭氏陽(yáng)性菌，無(wú)致病性，通過(guò)對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，其最適產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：肌酸添加量1.0%，酵母膏添加量0.8%，MgSO4·7H2O添加量0.05%，KH2PO4添加量0.2%，K2HPO4添加量0.05%，初始pH7.0。最佳發(fā)酵條件為：培養(yǎng)溫度25℃，通氣量40mL/100mL。通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀、Sephadex G-75凝膠過(guò)濾層析從粗酶液中純化出電泳純的肌氨酸氧化酶，純化后酶活為4.45 U/mL，純化倍數(shù)為2.66倍。SDS-PAGE結(jié)果顯示，肌氨酸氧化酶的分子質(zhì)量為43 kDa，為以芽孢桿菌作為“細(xì)胞工廠”工業(yè)化生產(chǎn)肌氨酸氧化酶及肌酐試劑盒的研究奠定了理論基礎(chǔ)。