陳 成,康虹健,張小菲,李秀玲*,梁鑫淼

(1.中國科學院大連化學物理研究所,中國科學院分離分析化學重點實驗室,遼寧 大連 116023;2.中國科學院大學 北京 100049)

蛋白質(zhì)糖基化作為一種重要的翻譯后修飾,參與蛋白質(zhì)折疊、亞細胞定位、更新和傳遞信息等生命活動[1-3],與病原體感染、腫瘤的發(fā)生和轉移等生物過程更是密不可分[4-6]。蛋白質(zhì)糖基化研究不僅有助于發(fā)現(xiàn)新生物標志物,開發(fā)新藥物,還可加深對蛋白質(zhì)生物功能的理解。

蛋白質(zhì)的糖基化分析主要依賴MS。雖然MS很強大,但MS分析前必須進行糖肽富集[7,8]。因為即使有超過50%的哺乳動物蛋白質(zhì)發(fā)生了糖基化,但糖肽數(shù)量占蛋白質(zhì)酶解肽段數(shù)量的比例卻不到5%[9]。且在MS分析中非糖肽還會對糖肽產(chǎn)生一定的離子抑制作用。

目前已發(fā)展了多種糖肽富集方法,如硼酸化學法[10,11]、肼化學法[12,13]、凝集素親和法[14-16]和親水作用色譜法(hydrophilic interaction liquid chromatography,HILIC)[17-19]等。每種方法都有其優(yōu)點和固有的局限性。在這些方法中凝集素親和法因特異性高和操作便捷等優(yōu)點應用廣泛[20]。每種凝集素識別的糖型不同,如麥胚凝集素(wheat germ agglutinin,WGA)富集含有N-乙酰葡糖胺和唾液酸的糖肽/蛋白質(zhì)[21],刀豆素A(convalina agglutinin,ConA)富集高甘露型糖肽[22],蛋白扁豆凝集素(lens culinaris lectin,LCA)富集巖藻糖糖肽/蛋白質(zhì)[23]。凝集素親和法是通過凝集素與特定的單糖、聚糖的糖序列之間非共價鍵可逆結合來富集糖肽。這種高特異性的蛋白-糖相互作用吸引了很多關注[24-26];凝集素對糖的特異性識別源于兩者之間的多氫鍵作用[27]、CH-π作用[28]和范德華力[29]等。其中糖和凝集素中芳香族氨基酸之間CH-π作用非常重要。在這種作用中,色氨酸參與的比例遠高于其他芳香族氨基酸[30]。

氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位。在自然界的20種氨基酸中,研究者已經(jīng)將天冬氨酸[31]、精氨酸[32]、半胱氨酸[33,34]和組氨酸[35]等分別修飾在硅球上,并用于糖肽的選擇性富集。但是還沒有用色氨酸作為功能單體的材料。受啟示于凝集素對糖蛋白的特異性識別,本文合成以色氨酸為功能單體的聚合物材料,并用于糖肽的選擇性富集。色氨酸作為唯一一種帶有吲哚基和苯環(huán)的氨基酸,與糖不僅會產(chǎn)生多氫鍵作用,還有產(chǎn)生CH-π作用。希望通過這一仿生材料的設計,為糖肽的富集材料提供新思路和新方向。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

UFLC 20A純化系統(tǒng)(日本島津公司),HYPERION 3000紅外光譜顯微及化學成像分析系統(tǒng)(德國布魯克光譜儀器公司),Zetasizer Nano納米激光粒度分析儀(英國馬爾文公司),JSM-7800F超高分辨熱場發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本電子),STA 449 F3同步熱分析儀(德國耐馳公司),nano ESI Q-TOF MS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Waters公司)。

GELoader吸頭小柱購于Eppendorf公司,C18HC固相萃取柱(100 mg/1 mL)和硅膠來自浙江華譜新創(chuàng)科技有限公司,C18膜片購自3M公司,ZIC-HILIC材料購于BioChem公司。

牛胎球蛋白(fetuin,純度≥99.8%)、牛血清白蛋白(bovine albumin,BSA,純度≥98.0%)、尿素(純度≥99%)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT,純度≥99%)、碘乙酰胺(iodoacetamide,IAA,純度≥98.0%)、胰蛋白酶(純度≥97%)、碳酸氫銨(純度≥99%)、甲酸(formic acid,FA,純度≥99%)、乙腈(ACN,色譜純)均購于Sigma公司。唾液酸糖肽標準品購于購于TCI公司。合成材料所需試劑均購于上海邁瑞爾化學技術有限公司。所有溶液均用Milli-Q去離子水配制。

1.2 實驗條件

1.2.1材料合成

Poly-Trp材料采用原子轉移自由聚合(atom-transfer radical-polymerization,ATRP)法進行合成。將0.505 g三乙胺(5 mol)加入30 mL含有1.15 g(5 mmol)色氨酸的干氯仿/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,冰浴攪拌10 min,然后逐滴加入0.45 mL(5 mol)質(zhì)量濃度為95%丙烯酰胺,室溫攪拌6 h,后用30 mL蒸餾水洗3次,蒸干溶劑。粗品用島津UFLC 20A純化系統(tǒng)進行純化(C18反相半制備柱),純化后得到丙烯酰胺-色氨酸(0.88 g,收率62%)備用。

室溫下將硅膠4.0 g(平均粒徑5.0 um,平均孔徑30 nm)懸浮于25 mL 0.1 mol/L鹽酸中48 h,使硅膠表面形成足夠的硅羥基。得到的硅膠經(jīng)漏斗抽濾,用水和甲醇依次洗滌3次,真空干燥。

將4.0 mL氨丙基三甲氧基硅烷溶于40 mL無水甲苯后,加入上一步處理過的硅膠,攪拌回流6 h。反應完后放入離心機,以7 000 r/min的速度離心5 min。得到的氨基修飾硅膠依次用無水甲苯和水處理,重復3次分散-沉淀循環(huán),去除未反應的材料,真空干燥。干燥后的氨基硅膠懸浮于30 mL二氯甲烷(含0.8 mL吡啶)中,在0 ℃于30 min內(nèi)逐滴滴入聚合引發(fā)劑溴異喹啉-丁?；寤?然后室溫攪拌過夜(避光反應),反應產(chǎn)物以7 000 r/min的速度離心5 min,再用干二氯甲烷分散-沉淀循環(huán)6次,真空干燥。

微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定棓丙酯氯化鈉注射液中8種金屬元素的含量 …………………… 鐘振華等（12）：1612

丙烯酰胺-色氨酸用20 mL蒸餾水做溶劑,加入上一步干燥后得到的BIBB-修飾的硅膠,進一步去氧,通過冷凍-解凍-泵循環(huán),然后加入溴化銅和N,N,N′,N′,N″-五甲基二亞乙基三胺(PMDETA)。所得溶液在60 ℃下攪拌6 h,再用7 000 r/min的速度離心8 min,然后依次用水-甲醇分散-沉淀循環(huán)洗3次,真空干燥即得Poly-Trp材料。

1.2.2蛋白質(zhì)標準品酶解和脫鹽

每1 mg蛋白質(zhì)標準品加入100 μL 6×103mol/L尿素,充分溶解后加5 μL 200 mmol/L DTT,于56 ℃振蕩孵化45 min。再加入20 μL IAA(200 mmol/L),放置于黑暗常溫環(huán)境30 min。然后用50 mmol/L碳酸氫銨水溶液稀釋10倍,加入25 μg胰蛋白酶,于37 ℃酶解過夜,最后加入5 μL甲酸終止反應。所得的蛋白質(zhì)酶解液濃度約為1 g/L。上述溶液均溶于50 mmol/L碳酸氫銨水溶液。

C18HC固相萃取柱(脫鹽柱)首先用600 μL 50%(體積分數(shù),下同)ACN/0.1%FA水溶液活化,再加入600 μL 0.1%FA水溶液平衡,然后加入3 mL BSA酶解液上樣。上樣后用1 200 μL 0.1%FA水溶液淋洗,用600 μL 50%ACN/0.1%FA水溶液洗脫。洗脫液按相應的摩爾比例和fetuin酶解液進行混合。fetuin酶解液脫鹽步驟同BSA。

1.2.3乙腈濃度對Poly-Trp材料保留糖肽的影響

稱取1 mg Poly-Trp材料,加入乙腈混勻,加壓至塞有單層3M C18膜片的Eppendorf槍頭,裝填成微型SPE小柱。依次用40 μL 50%ACN/0.2%FA和40 μL 85%ACN/0.2%FA水溶液清洗、平衡材料。取10 μg fetuin(溶于30 μL 85%ACN/0.2%FA)上樣,分別用80%ACN/0.2%FA、70%ACN/0.2%FA、60%ACN/0.2%FA、50%ACN/0.2%FA各30 μL淋洗,所得餾分進MS分析。

1.2.4酸度對Poly-Trp保留糖肽的影響

1.2.5Poly-Trp材料富集糖肽的選擇性

稱取1 mg Poly-Trp材料放入微量離心管中,加入100 μL 50%ACN/0.1%FA水溶液清洗振蕩5 min后離心,移除上清后加入100 μL 80%ACN/2%FA振蕩平衡。

加入10倍去鹽后的BSA:5 μg fetuin和71.6 μg BSA酶解液一起用C18HC固相萃取小柱去鹽至71.6 μL 50%ACN/0.1%FA水溶液中,加乙腈和甲酸調(diào)整溶液含量至80%ACN/2%FA后上樣,孵化40 min后均勻加壓裝填入塞有單層3M C18膜片的GELoader小柱。用20 μL 80%ACN/2%FA淋洗2次,最終用20 μL 60%ACN洗脫。洗脫液進MS分析。

加入100倍去鹽后的BSA:5 μg fetuin和716 μg BSA酶解液一起用C18HC固相萃取小柱去鹽至716 μL 50%ACN/0.1%FA水溶液中,加乙腈和甲酸調(diào)整溶液含量至80%ACN/2%FA后上樣,孵化40 min后離心去除上清。加入100 μL 80%ACN/2%FA,清洗振蕩5 min后去除大部分上清,剩下混勻加壓裝填入塞有單層3M C18膜片的GELoader小柱。用20 μL 80%ACN/2%FA淋洗3次,最終用20 μL 60%ACN洗脫。洗脫液進MS分析。

1.2.6ZIC-HILIC材料富集糖肽的選擇性

同文獻方法[36]。

1.2.7氨基硅膠材料富集糖肽的選擇性

同1.2.5節(jié)方法準備材料及樣品,5 μg fetuin和716 μg BSA酶解液一起用C18HC固相萃取小柱去鹽至716 μL 50%ACN/0.1%FA水溶液中,加乙腈和甲酸調(diào)整溶液含量至85%ACN/1%FA。上樣后用20 μL 80%ACN/1%FA淋洗4次,最后用80 μL 10%氨水洗脫。洗脫液用C18小柱去鹽至20 μL,進MS分析。

1.2.8Poly-Trp材料吸附量

1 mg fetuin酶解液用C18HC固相萃取小柱去鹽至600μL 50%ACN/0.1%FA,加乙腈和甲酸調(diào)整溶液體積及含量至4 mL 85%ACN/2%FA。取1.39 mg材料裝填SPE小柱,清洗平衡柱,取40 μL(含10 μg fetuin)多次上樣,每次的流出液進MS分析。

1.2.9Poly-Trp材料檢出限

稱取唾液酸糖肽標準品,配置成不同質(zhì)量濃度的溶液(溶劑為85%ACN/2%FA)。分別取上述溶液1 mL與1 mg Poly-Trp材料孵化上樣15 min,然后用20 μL 60%ACN洗脫進MS分析。

2 結果與討論

2.1 Poly-Trp材料表征

采用ATRP法合成的Poly-Trp材料,其結構示意圖如圖1所示。所合成的材料通過掃描電鏡、紅外光譜分析儀、熱重分析儀和電勢測定儀等進行分析表征。掃描電鏡的結果表明,鍵合后硅球形狀沒有發(fā)生顯著改變(見圖2a)。從Poly-Trp材料的熱重分析曲線圖可知,160 ℃以前材料有失重,推測是材料表面物理吸附水所致;而在160～220 ℃間失重可能源于硅球表面的脫水作用;220～420 ℃間失重則應是硅球表面鍵合的有機聚合物分子鏈斷裂導致(見圖2b)。進一步對Poly-Trp材料進行傅里葉紅外分析并對主要譜峰進行了歸屬,圖中強吸收峰1 083和460 cm-1分別對應硅球的Si-O-Si和Si-O基峰,相對較弱的峰有1 615和3 406 cm-1,前者源于色氨酸上苯環(huán)骨架的伸縮振動,后者可歸于色氨酸中吡咯環(huán)的仲氨峰(見圖2c)。最終測定材料的Zeta電勢等電點為3.59(見圖2d)。上述結果表明,Poly-Trp材料已經(jīng)成功制備。

圖1 Poly-Trp材料的化學結構Fig.1 Chemical structure of tryptophan functionalizedpolymer materials(Poly-Trp)

圖2 Poly-Trp材料表征圖Fig.2 Characterizations of Poly-Trp material a.scanning electron microscopic image;b.thermogravimetric (TG)analysis curve;c.infrared spectroscopy spectrum;d.zeta potential curve.

2.2 乙腈濃度對Poly-Trp材料保留糖肽的影響

在考察Poly-Trp材料富集糖肽選擇性之前,首先考察了不同乙腈濃度的溶液條件下,fetuin酶解液中糖肽和非糖肽在Poly-Trp材料上的保留情況。由于fetuin酶解液中肽段種類較多,為方便后面的討論,從fetuin酶解液中選取了3個有代表性的糖肽(分別命名為GP1、GP2、GP3)和2個有代表性的非糖肽(分別命名為NP1、NP2),這些肽段的信息詳見表1。圖3是0.2%FA條件下85%ACN、80%ACN、70%ACN、60%ACN、50%ACN依次洗脫后,每個肽段信號分布的結果圖。肽段信號分布定義為(某一乙腈餾分MS圖中目標肽段的強度/各餾分MS圖中目標肽段的強度總和)×100%。首先比較非糖肽和糖肽的保留情況,非糖肽NP1和NP2主要集中在85%ACN和80%ACN餾分中,糖肽GP1-3出現(xiàn)在70%ACN及以下餾分,這個結果說明Poly-Trp材料對親水性糖肽保留強于疏水的非糖肽。Poly-Trp對肽段的保留隨著乙腈濃度的降低而變?nèi)?這一現(xiàn)象符合親水作用色譜的保留特點。其次,對于非糖肽而言,NP1在85%ACN中信號分布為7.7%,在80%ACN中信號分布為80.2%;NP2在85%ACN中信號分布為60.1%,在80%ACN中信號分布為28.5%(見圖3)。如表1所示，NP1在Poly-Trp材料上的保留強于NP2,主要是由于NP1的親水性(親水系數(shù)為-0.35)高于NP2(親水系數(shù)為1.104)。另外,隨著乙腈濃度的降低,溶液對非糖肽洗脫強度逐漸增大。對親水性較強的糖肽而言,糖肽出現(xiàn)在70%ACN餾分至50%ACN餾分區(qū)間。具有相同肽鏈而糖鏈長度逐漸增加的糖肽GP1、GP2、GP3(見表1)在Poly-Trp材料上的保留依次增強,表現(xiàn)為在60%ACN餾分中的信號分布相應增多:36.2%、41.1%和46.1%(見圖3)。這兩個現(xiàn)象也符合親水作用色譜的保留特點,說明親水在一定程度上參與糖肽的保留。綜合以上結果可知,降低乙腈濃度,肽段在Poly-Trp材料上的保留行為基本符合親水作用色譜保留特點。

表1 fetuin酶解液中選取的代表性肽段信息Table1 Selected specific peptides information in fetuin digest

NP:noglycopeptide;GP:glycopeptide;Hex:hexoses;HexNAc:hexosamines;NueAC:sialic acid.

圖3 不同乙腈濃度對肽段在Poly-Trp材料上保留的影響Fig.3 Effects of different ACN concentrations to the peptide retention on the Poly-Trp material

2.3 酸度對Poly-Trp保留糖肽的影響

圖4 不同甲酸體積分數(shù)對肽段在Poly-Trp材料上保留的影響Fig.4 Effects of different FA(formic acid)volumepercentages to the peptide retention on the Poly-Trp material

在上述不同乙腈濃度對肽段在Poly-Trp材料上保留的研究基礎上,改變?nèi)芤旱乃岫?考察了不同酸度條件下材料對肽段保留的影響,結果見圖4。在不含F(xiàn)A即中性條件下,3種糖肽和NP2主要分布在85%ACN餾分中,非糖肽NP1主要分布于80%ACN餾分中,整體保留較弱。推測在中性條件下,材料帶負電,非糖肽NP1-2和糖肽GP1-3也帶負電,強烈的靜電排斥作用使它們幾乎不在Poly-Trp材料上保留。當加入0.2%FA(pH 2.51)、1%FA(pH 2.15)和2%FA(pH 2)時,隨著酸度的增加,非糖肽NP1和NP2分布向85%ACN餾分集中。如2%FA條件下NP1在85%ACN餾分中信號分布為93%,在1%FA條件下NP2在85%ACN餾分中信號分布為90.4%。分析當溶液pH值小于2.51時,材料帶正電,非糖肽也帶正電,酸度的增加使材料和非糖肽之間的靜電排斥越來越強,非糖肽基本不被Poly-Trp材料保留。糖肽在上述FA條件下應帶負電或接近電中性,靜電吸引逐漸減弱,結果顯示3個糖肽在材料上的保留區(qū)間雖然沒有變化(70%ACN～50%ACN),但是在70%ACN餾分中信號分布有不同程度的增加。綜上,中性條件下,Poly-Trp材料與fetuin糖肽之間的靜電排斥作用利于洗脫,與非糖肽之間的靜電排斥作用使非糖肽和糖肽保留交叉,不利于富集;提高甲酸濃度,借助材料與非糖肽之間的靜電排斥作用,通過在高乙腈相條件下淋洗去除大部分的非糖肽,可提高Poly-Trp材料富集糖肽的選擇性。

2.4 Poly-Trp材料選擇性富集糖肽

在上述研究的基礎上,使用feutin酶解液為樣品優(yōu)化了Poly-Trp材料富集糖肽的條件:上樣條件為85%ACN/2%FA,淋洗條件為80%ACN/2%FA,洗脫條件為60%ACN。采用這樣的富集條件,fetuin酶解液經(jīng)Poly-Trp材料富集后得到29條糖肽,有效去除了非糖肽(見圖5a)。而自然界中的生物樣品往往更為復雜,為考察Poly-Trp材料富集糖肽的選擇性,將含量相對較高的BSA作為干擾物加入fetuin酶解液中再進行富集。當摻入物質(zhì)的量倍數(shù)為10的BSA時,Poly-Trp材料一共富集到25條糖肽(見圖5d),高于作為對照、沒有鍵合上丙烯酰胺化色氨酸官能團的氨基硅膠材料富集到的9條糖肽(見圖5b)。說明Poly-Trp材料富集糖肽具有一定的抗干擾能力,同時證明材料的富集選擇性來自于鍵合上的丙烯酰胺化色氨酸官能團。進一步摻入物質(zhì)的量倍數(shù)為100的BSA時,Poly-Trp材料仍能富集到20條糖肽(見圖5e)。對比商品化ZIC-HILIC材料,重復3次富集摻入物質(zhì)的量倍數(shù)為50的BSA(圖見5c)時只能看見fetuin糖肽中相對豐度較高的1 634.3 495(4+)。Poly-Trp材料相對ZIC-HILIC材料,在較為復雜的樣品中顯現(xiàn)了較好的選擇性。同時測得Poly-Trp材料對糖肽的吸附量為21.6 mg/g(fetuin酶解液),且具有較好的檢出限(3.44 μmol/L,唾液酸糖肽標準品,信噪比大于3)。上述結果表明,Poly-Trp材料可實現(xiàn)糖肽的高效富集。

圖5 Poly-Trp材料和兩種對照材料富集糖肽MS譜圖Fig.5 Mass spectra of glycopeptides enriched with Poly-Trp and two control materials a.mass spectrum of glycopeptides enriched from digests of fetuin with Poly-Trp material;b.mass spectrum of glycopeptides enriched from digests of fetuin and BSA (bovine albumin)at amount of substance ratio of 1∶10 with aminated silica;c.mass spectrum of glycopeptides enriched from digests of fetuin and BSA at amount of substance ratio of 1∶50 with ZIC-HILIC material;d.mass spectrum of glycopeptides enriched from digests of fetuin and BSA at amount of substance ratio of 1∶10 with Poly-Trp material;e.mass spectrum of glycopeptides enriched from digests of fetuin and BSA at amount of substance ratio of 1∶100 with Poly-Trp material.Glycopeptides are marked with lines.

3 結論

在本研究中合成了一種新型仿生聚合物材料Poly-Trp,并對其結構進行了表征。通過考察不同乙腈濃度、酸度等溶液條件對肽段在材料上保留的影響,優(yōu)化了糖肽的富集條件。在此基礎上,通過加入BSA作為干擾物,與兩種對照材料富集結果依次進行對比,驗證了Poly-Trp材料選擇性來自于鍵合上的色氨酸官能團,且Poly-Trp材料對糖肽的富集選擇性優(yōu)于商品化ZIC-HILIC材料。Poly-Trp材料對糖肽的高富集選擇性證明了仿生聚合物材料設計的可行性,該類材料在糖肽的選擇性富集領域具有潛力,對其進行深入的研究及進一步開發(fā)將為糖肽富集新材料的研發(fā)提供新的思路。