樂思秀，王 靜，李國林，李 師，王 鑫，白九元，趙 云

(四川大學生命科學學院生物資源與環(huán)境教育部重點實驗室，四川 成都 610065)

濕地系指自然或人工、長久或暫時性的沼澤地、泥炭地或水域地帶，靜止或流動的淡水、半咸水、咸水體，包括低潮時水深不超過6 m的水域[1]。濕地系統(tǒng)與森林、海洋并稱為全球三大生態(tài)系統(tǒng)，作為一個特殊的生態(tài)系統(tǒng)，對生物圈的穩(wěn)定有著不可或缺的作用。

隨著社會工業(yè)化進程的加快，濕地環(huán)境污染問題也越發(fā)嚴重，其中以水體富營養(yǎng)化最顯著。水體富營養(yǎng)化不僅影響水生生物的生長，同時也會對人類健康造成危害，其產(chǎn)生的最大原因是人類活動中產(chǎn)生的大量含氮、磷的污水未經(jīng)處理直接排放到自然水體中，導致水體功能惡化，水生系統(tǒng)遭到破壞，進而促使水體中藻類的爆發(fā)性增長，造成“水華”現(xiàn)象。據(jù)相關(guān)報道，世界上25%～70%的水體產(chǎn)生水華現(xiàn)象后都會產(chǎn)生次生有毒代謝物—藻毒素，而微囊藻毒素(Microcystin,MCs)則是水體富營養(yǎng)化后出現(xiàn)頻率最高、釋放量最多、危害最大的藻毒素[2]。微囊藻毒素可以通過食物鏈進入動物體內(nèi)，導致動物肝臟細胞抗氧化系統(tǒng)紊亂，引發(fā)肝癌而致死[3]。如何簡單有效地處理這些污水、抑制藻類生長、改善水體環(huán)境已成為近幾年來的研究熱點。研究者們嘗試了許多方法來解決水體的富營養(yǎng)化問題[4～6]，主要修復(fù)方法有物理、化學、生物修復(fù)，物理化學修復(fù)很容易造成二次污染，且成本較高，因此利用水生生態(tài)系統(tǒng)中原有的水生植物對這些污水進行修復(fù)是現(xiàn)在普遍應(yīng)用的方法[7]。

浮萍科植物生長在靜止或緩慢流動的淡水中，約有37個種，5個屬(Spirodela,Landoltia,Lemna,Wolffiella和Wolffia)[8]，廣泛分布在世界各地。浮萍進行無性生殖，因此生長速度快，生物量能在短時間(2 d～7 d)內(nèi)增長1倍，且生長周期可達9～12個月，因此能快速降低污水中氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)和其他污染物[9]。同時浮萍的適應(yīng)能力強，附帶價值高，相關(guān)研究表明，許多浮萍物種的淀粉含量在3%～75%之間[10]，全株可作為魚類和家禽家畜的飼料。浮萍還是一種新型能源植物，因為其高蛋白、高淀粉等特點被廣泛用于酒精發(fā)酵[11]、燃料乙醇[12,13]等。因此在利用浮萍凈化污染水體時，既可減少水中過剩的營養(yǎng)元素，還可在一定程度上抑制藻類生物的生長，防止其大量繁殖造成水華現(xiàn)象，從而抑制有毒物質(zhì)的釋放。同時浮萍采收方式簡單，經(jīng)過加工，可實現(xiàn)資源與物質(zhì)的循環(huán)利用，是一種具有廣闊前景的植物。

本實驗以少根紫萍(ZHOO51)和銅綠微囊藻(FACHB930)為材料，通過室內(nèi)模擬富營養(yǎng)化水體，將不同濃度梯度少根紫萍和銅綠微囊藻單獨或共培養(yǎng)，研究少根紫萍對水體修復(fù)情況等，找出最適共培養(yǎng)濃度，為少根紫萍用于濕地污染水體修復(fù)研究提供一點實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa，F(xiàn)ACHB-930)，購買于中國科學院武漢水生生物研究所淡水藻種庫，用BG11培養(yǎng)液培養(yǎng)擴增。少根紫萍(Spirodelapunctata，ZH0051)，取自中國科學院成都生物研究所，用Hoagland培養(yǎng)液進行擴大培養(yǎng)繁殖，以備后續(xù)實驗使用。

1.2 實驗設(shè)計

本實驗于四川大學生命科學學院B區(qū)9樓組培室進行，組培室平均溫度為24℃。實驗采用室內(nèi)模擬富營養(yǎng)化水體的方式，選用17.5 cm×12.5 cm×5.5 cm的不透光的塑料盒為實驗器具，每個塑料盒中加入800 mL的1/5 Hoagland培養(yǎng)液。

將銅綠微囊藻在BG11培養(yǎng)液中培養(yǎng)至藻濃度為107個·mL-1，而后以此為母液，按照0 mL·L-1、20 mL·L-1、40 mL·L-1、80 mL·L-1、160 mL·L-1(實際銅綠微囊藻接種濃度為0、2×108、4×108、8×108、1.6×109個·mL-1)5個濃度梯度，向塑料盒中接種銅綠微囊藻。挑選長勢良好的少根紫萍，用自來水沖洗多次后再用蒸餾水清洗，去除少根紫萍表面的污垢雜質(zhì)。而后按照以下5個濃度梯度：0 mg·m-2、100 mg·m-2、200 mg·m-2、400 mg·m-2、800 mg·m-2，采用雙因素5×5正交試驗，將上述銅綠微囊藻和少根紫萍接種于Hoagland培養(yǎng)液中。每隔3 d測定培養(yǎng)液中TN、TP的含量。培養(yǎng)15 d后，測定培養(yǎng)液和少根紫萍體內(nèi)銅綠微囊藻毒素(MCS)含量。實驗期間蒸發(fā)的水分用蒸餾水補充，每個處理設(shè)置3個生物學重復(fù)。

1.3 實驗方法

1.3.1 少根紫萍生長狀況的測定 植物鮮重測定：除去其表面水分后，按照Bergmann的方法[11]進行測量。植物干重測定：稱取容器體積約3/4的少根紫萍，脫水放置于50℃的烘箱烘干至恒重后測定少根紫萍的干重。葉綠素含量的測定：利用丙酮乙醇混合液法[14]。

1.3.2 TN、TP含量的測定 TN含量測定采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測(GB11894-89)[15]。 TP含量測定采用鉬酸銨分光光度法測定含量(GB11893-89)[16]。

1.3.3 藻毒素含量測定 藻毒素含量測定采用雙抗體夾心法[17]所需試劑及操作步驟參考上海酶聯(lián)生物公司微囊藻毒素酶聯(lián)免疫分析試劑盒測定。

1.4 分析方法

所有數(shù)據(jù)均使用Microsoft Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)處理，并用Graphpad Prism 7.0進行作圖，采用IBM SPSS Statistics 19.0軟件進行單因素、雙因素方差分析和LSD多重比較分析。用不同的小寫字母a、b和c等表示在同一少根紫萍濃度下，不同銅綠微囊藻濃度處理間的顯著差異性(p<0.05)。

2 實驗結(jié)果

2.1 銅綠微囊藻對少根紫萍生長的影響

不同濃度的銅綠微囊藻對少根紫萍的生長影響不同，如圖1 a～d所示，隨著銅綠微囊藻濃度的增加，少根紫萍的鮮重、干重、增長率及總?cè)~綠素均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。在銅綠微囊藻濃度為20 mL·L-1時，少根紫萍鮮重、干重、增長率及總?cè)~綠素含量均顯著高于其他處理組。銅綠微囊藻濃度為40 mL·L-1與80 mL·L-1時，少根紫萍的鮮重、干重(濃度400 mg·m-2組除外)與空白對照相比無顯著性差異，而在銅綠微囊藻濃度為160 mL·L-1時，所有濃度少根紫萍的鮮重、干重及增長率均顯著低于對照組。隨著少根紫萍濃度的增加，鮮重和干重逐漸增加，但增長率和總?cè)~綠素則呈現(xiàn)先增加后下降。在銅綠微囊藻濃度為20 mL·L-1時、少根紫萍濃度為400 mg·m-2時，少根紫萍的干重(2.03 mg)、總?cè)~綠素(0.624 mg)最高均是組內(nèi)最高，表明低濃度銅綠微囊藻在一定程度促進了少根紫萍的生長。

圖1 銅綠微囊藻對少根紫萍生長的影響Fig.1 Effects of Microcystis aeruginosa on the growth of Spirodela punctataa:鮮重；b:干重；c:鮮重增長率；d:總?cè)~綠素含量；不同顏色柱為不同銅綠微囊藻濃度;不同字母表示同組數(shù)據(jù)間存在顯著差異性，p<0.05

2.2 培養(yǎng)液中TN含量的變化

圖2為少根紫萍和銅綠微囊藻共培養(yǎng)后培養(yǎng)液中TN含量隨時間的變化趨勢圖。當銅綠微囊藻單獨培養(yǎng)時，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，TN含量隨著接種濃度的增加而逐漸降低，且培養(yǎng)液中TN含量下降速度較為緩慢，當培養(yǎng)6 d后達到相對穩(wěn)定的狀態(tài)，到15 d后下降到36.24 mg·L-1～46.69 mg·L-1。接種少根紫萍后，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，所有少根紫萍接種濃度培養(yǎng)液中的TN含量逐漸減少。少根紫萍濃度為100 mg·m-2和200 mg·m-2時，培養(yǎng)9 d后少根紫萍對TN進入緩慢吸收狀態(tài)，到15 d后下降到29.60 mg·L-1～36.54 mg·L-1和29.34 mg·L-1～38.17 mg·L-1；少根紫萍濃度為400 mg·m-2和800 mg·m-2時，TN含量培養(yǎng)12 d后進入緩慢吸收狀態(tài)，到15 d后下降到23.88 mg·L-1～31.57 mg·L-1和17.85 mg·L-1～26.73 mg·L-1。其中銅綠微囊藻濃度為20 mL·L-1時，各少根紫萍處理組吸收效果均為最好。

圖2 培養(yǎng)液中TN含量的變化趨勢(不同折線表示不同銅綠微囊藻濃度)Fig.2 The TN content (mg·L-1) in the culture medium少根紫萍接種量：a:0 mg·m-2;b:100 mg·m-2;c:200 mg·m-2;d:400 mg·m-2;e:800 mg·m-2

2.3 培養(yǎng)液中TP含量的變化

圖3為少根紫萍和銅綠微囊藻共培養(yǎng)后培養(yǎng)液中TP含量隨時間的變化趨勢圖。如圖3所示，當銅綠微囊藻單獨培養(yǎng)時，TP含量下降速度雖然較為緩慢，但隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，TP含量隨著銅綠微囊藻接種濃度的增加而逐漸降低，當培養(yǎng)6 d后達到相對穩(wěn)定狀態(tài)，進入緩慢吸收階段，到15 d后下降到14.40 mg·L-1～23.68 mg·L-1。接種少根紫萍后，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，所有少根紫萍接種濃度培養(yǎng)液中的TP含量逐漸減少；少根紫萍濃度為100 mg·m-2和200 mg·m-2時，TN含量培養(yǎng)6 d后進入緩慢吸收狀態(tài)，15 d后下降到6.38 mg·L-1～10.48 mg·L-1和5.54 mg·L-1～9.66 mg·L-1；少根紫萍濃度為400 mg·m-2和800 mg·m-2時，存在兩個階段，0～3 d時，是快速吸收階段，吸收了63.36%～75.44%和80.39%～90.92%；培養(yǎng)3 d后進入緩慢吸收狀態(tài)， 15 d后下降到4.57 mg·L-1～7.06 mg·L-1和0.65 mg·L-1～2.15 mg·L-1。當少根紫萍濃度為800 mg·m-2時，對TP的吸收效果最好。

圖3 培養(yǎng)液中TP含量的變化趨勢(不同折線表示不同銅綠微囊藻濃度)Fig.3 The TP content (mg·L-1) in the culture medium少根紫萍接種量：a:0 mg·m-2;b:100 mg·m-2;c:200 mg·m-2;d:400 mg·m-2;e:800 mg·m-2

2.4 培養(yǎng)液中TN、TP去除率的變化

圖4為銅綠微囊藻和少根紫萍共培養(yǎng)15 d后培養(yǎng)液中TN、TP去除率。如圖4所示，未接種少根紫萍時，僅靠銅綠微囊藻吸收營養(yǎng)物質(zhì)，TN、TP去除率隨著銅綠微囊藻濃度的增加逐漸升高。而接種少根紫萍后，TN去除率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，0～20 mL·L-1上升，20 mL·L-1～160 mL·L-1下降，在20 mL·L-1到達最大值，分別為48.50%、48.94%、58.45%、67.95%。TP去除率呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢，0～20 mL·L-1上升，20 mL·L-1～80 mL·L-1下降，80 mL·L-1～180 mL·L-1上升。在20 mL·L-1和160 mL·L-1到達高峰，分別為79.23%、81.88%、87.56%、98.31%和83.33%、85.53%、88.01%、93.21%。隨著少根紫萍濃度的加大，TN、TP去除率也逐漸增加，在濃度為800 mg·m-2時，TN、TP的去除率達到最大。

2.5 培養(yǎng)液及少根紫萍中微囊藻毒素含量的變化

圖5為銅綠微囊藻與少根紫萍共培養(yǎng)15 d后培養(yǎng)液及少根紫萍體內(nèi)微囊藻毒素(MCs)含量的變化圖。從圖5a可以看出，未接種少根紫萍時，培養(yǎng)液中的MCs含量隨銅綠微囊藻濃度的增加而增加；接種少根紫萍后，在銅綠微囊藻為20 mL·L-1時，培養(yǎng)液中的MCs含量均為最低。隨著少根紫萍濃度的增加，培養(yǎng)液中的MCs先下降后上升，在少根紫萍濃度為400 mg·m-2時，其含量最低。當銅綠微囊藻濃度為20 mL·L-1、少根紫萍濃度為400 mg·m-2時，培養(yǎng)液中的MCs含量最低為8.41 μg·mL-1。圖5b為少根紫萍體內(nèi)的MCs含量，隨著銅綠微囊藻和少根紫萍濃度的增加，少根紫萍體內(nèi)的MCs含量先上升后下降；在少根紫萍濃度為400 mg·m-2時，所以銅綠微囊藻接種濃度中根紫萍體內(nèi)的MCs含量均為最高。當銅綠微囊藻濃度為20 mL·L-1、少根紫萍濃度為400mg·m-2時，少根紫萍體內(nèi)的MCs含量最高為286.87 μg·g-1，說明少根紫萍吸收了培養(yǎng)液中的MCs，凈化了水體。

圖5 培養(yǎng)液及少根紫萍體內(nèi)微藻毒素含量Fig.5 The content of microcystins in the culture medium and Spirodela punctata不同顏色柱為不同銅綠微囊藻濃度;不同字母表示同組數(shù)據(jù)間存在顯著差異性，p<0.05

2.6 不同濃度少根紫萍及銅綠微囊藻雙因素方差分析表

表1為不同濃度少根紫萍及銅綠微囊藻對各指標雙因素方差分析結(jié)果。從表中可以看出，少根紫萍和銅綠微囊藻濃度單獨作用時，少根紫萍鮮重、干重、鮮重增長率、總?cè)~綠素、少根紫萍體內(nèi)MCs含量、培養(yǎng)中TN、TP的去除率以及MCs含量p值均小于0.05，表明各單因素對少根紫萍鮮重、干重、鮮重增長率和總?cè)~綠素含量均有顯著影響，對TN、TP的去除率及MCs含量也存在顯著影響。但當二者交互作用后，少根紫萍鮮重p=0.316、干重p=0.119均大于0.05，表明二者交互作用對少根紫萍鮮重、干重則不存在顯著影響。但少根紫萍鮮重增長率、總?cè)~綠素、少根紫萍體內(nèi)MCs含量、培養(yǎng)中TN、TP的去除率以及MCs含量p值均小于0.05，表明二者交互作用后對污染水體修復(fù)具有顯著作用，說明少根紫萍與銅綠微囊藻共培養(yǎng)后對污染水體的修復(fù)比單獨培養(yǎng)具有更好的效果。

表1雙因素重復(fù)實驗方差分析表

p值表示數(shù)據(jù)間顯著差異性，p<0.05

3 討論

3.1 銅綠微囊藻對少根紫萍生長的影響

銅綠微囊藻和少根紫萍共培養(yǎng)15 d后，接種了20 mL·L-1銅綠微囊藻濃度的處理下，少根紫萍的鮮重、干重、增長率及葉綠素含量均增加，說明低濃度的銅綠微囊藻促進了少根紫萍的生長；而接種了160 mL·L-1銅綠微囊藻濃度的處理下，少根紫萍的鮮重、干重、增長率及葉綠素含量均呈現(xiàn)下降的趨勢，說明高濃度的銅綠微囊藻抑制了少根紫萍的生長。銅綠微囊藻和少根紫萍均為水生生物，可利用陽光、營養(yǎng)物質(zhì)進行生長，因此兩者之間存在一定的競爭。當水體中銅綠微囊藻數(shù)量較少時，產(chǎn)生的藻毒素也較少，對少根紫萍造成的脅迫程度較低，對其造成的危害不大，反而可增加其競爭性，在一定程度上促進少根紫萍對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收；且銅綠微囊藻呼吸作用產(chǎn)生的CO2還可提高少根紫萍的光合作用效率，從而促進了少根紫萍的生長。反之，當接種的銅綠微囊藻數(shù)量較大，使其成為優(yōu)勢物種，不但利用水中的營養(yǎng)物質(zhì)進行大量繁殖，減少少根紫萍的營養(yǎng)物質(zhì)吸收量，而且當其生物量達到一定程度后造成水華現(xiàn)象，降低水中溶氧量，改變水體環(huán)境；同時銅綠微囊藻還會產(chǎn)生藻毒素，對少根紫萍造成脅迫，影響其葉綠素含量的合成、降低光合作用效率等[18]，從而影響少根紫萍的生長。隨著少根紫萍濃度的增大，其鮮重、增長率及葉綠素含量先增加后降低，可能是因為濃度較低時少根紫萍群落未達到飽和，鮮重、增長率及葉綠素含量隨濃度的增加而增加；而當少根紫萍群落達到飽和后，濃度過大導致其覆蓋密度過大、間距過小，造成擁擠和老化現(xiàn)象，由此降低了其增長率。同時擁擠的環(huán)境還會造成部分少根紫萍光照不足，降低光合作用，從而影響少根紫萍的生長。

3.2 少根紫萍對污染水體TN、TP的影響

TN、TP含量是富營養(yǎng)化水體的主要指標之一。TN、TP等營養(yǎng)物質(zhì)過多會造成水生生物特別是藻類生物的大量繁殖，從而促使“水華”、“赤潮”等現(xiàn)象頻發(fā)。許多研究均表明浮萍對污染水體中TN、TP具有較好的吸收效果。于斌研究表明稀脈浮萍對自然水體中TN、TP的去除率可達78.58%和90.26%[19]。王春英等也研究表明小浮萍對P的去除率介于90%～95%[20]。本實驗中銅綠微囊藻和少根紫萍共培養(yǎng)降低了水體中TN、TP含量。其中少根紫萍濃度為800·m-2時，TN、TP去除率最大，但此時少根紫萍生長狀況較差，達不到物質(zhì)的最大利用效率；少根紫萍濃度為400 mg·m-2時，TN、TP去除率也較高，少根紫萍生長狀況也較好。在銅綠微囊藻為20 mL·L-1時營養(yǎng)物質(zhì)去除效果最好，此時銅綠微囊藻與少根紫萍形成一個穩(wěn)定的生長狀態(tài)，銅綠微囊藻與少根紫萍在整個群落中均為優(yōu)勢物種，可吸收水中營養(yǎng)物質(zhì)來促進自身的生長，達到水體修復(fù)和物質(zhì)充分利用的雙贏局面。因此可根據(jù)銅綠微囊藻的數(shù)量設(shè)計與少根紫萍共培養(yǎng)的最適濃度，達到最佳污水處理和物質(zhì)的最大利用率。

3.3 少根紫萍對污染水體微囊藻毒素的影響

銅綠微囊藻細胞死亡破裂后會釋放藻毒素，污染水體。許多研究表明水生生物可積累藻毒素，尹黎燕等發(fā)現(xiàn)微囊藻可在水生植物苦草中積累[21]。宋海亮也發(fā)現(xiàn)水生植物床可有效地去除富營養(yǎng)化水中的藻毒素[22]。本實驗空白對照組培養(yǎng)液中的MCs含量隨著銅綠微囊藻濃度的增加而增加；當銅綠微囊藻與少根紫萍共培養(yǎng)后，培養(yǎng)液中的MCs含量均少于銅綠微囊藻單獨培養(yǎng)，證明少根紫萍降低了培養(yǎng)液中的MCs含量。而隨著少根紫萍濃度的增加，培養(yǎng)液中MCs含量先減少后增加，少根紫萍體內(nèi)微囊藻毒素先增加后減少，這與少根紫萍的生長狀況一致，表明少根紫萍生長狀況對微囊藻毒素存在一定的影響。少根紫萍與銅綠微囊藻共培養(yǎng)后水體中MCs降低，少根紫萍體內(nèi)微囊藻毒素上升，表明少根紫萍可吸收水體中的微囊藻毒素，達到修復(fù)水體的目的。同時少根紫萍和銅綠微囊藻對水體中的營養(yǎng)物質(zhì)、光照等還存在競爭關(guān)系，可抑制其繁殖速度，減少銅綠微囊藻細胞數(shù)量；同時少根紫萍漂浮在水面生長，到其數(shù)量較多時，在一定程度上會遮住水面，導致銅綠微囊藻無法獲得陽光，降低其光合作用，從而減少水中藻類數(shù)量，最終減少銅綠微囊藻細胞死亡裂解后釋放的MCs。

4 結(jié)論

銅綠微囊藻和少根紫萍共培養(yǎng)比各自單獨培養(yǎng)對污染水體具有更好的修復(fù)效果。低濃度銅綠微囊藻可促進少根紫萍生長，高濃度銅綠微囊藻抑制少根紫萍生長。當水體中銅綠微囊藻生物量為2.0×108個·mL-1左右，少根紫萍為400mg·m-2時，少根紫萍的生長狀況最好，且對污染水體的修復(fù)效果較好。因此可以選擇低濃度銅綠微囊藻和400mg·m-2的少根紫萍共培養(yǎng)用于濕地污染水體修復(fù)。