謝穎穎

(1.國(guó)家茶葉產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(四川)，四川 雅安 625000；2.四川省雅安市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，四川 雅安 625000)

測(cè)量不確定度是“表征合理地賦予被測(cè)量之值的分散性，與測(cè)量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)”[1]。測(cè)量不確定度可以衡量測(cè)量過(guò)程是否持續(xù)受控，測(cè)量結(jié)果是否保持穩(wěn)定一致，可以找出影響測(cè)量結(jié)果的最主要因素，并加以控制改進(jìn)。測(cè)量不確定度越大，表示測(cè)量能力越差；反之，表示測(cè)量能力越強(qiáng)。

茶葉水浸出物中具有α-氨基的有機(jī)酸且呈游離狀態(tài)存在者，均稱(chēng)茶葉游離氨基酸。該指標(biāo)與茶葉的“鮮香”特征有關(guān)。有關(guān)測(cè)量茶葉中游離氨基酸總量的不確定度評(píng)定，未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本文以四川省雅安市蒙頂山甘露茶葉為例，根據(jù)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布的JJF 1059.1-2012計(jì)量技術(shù)規(guī)范《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[1]和中國(guó)金屬學(xué)會(huì)分析測(cè)試分會(huì)發(fā)布的CSM 01 01 01 02-2006《分光光度法測(cè)量結(jié)果不確定度評(píng)定規(guī)范》[2]，對(duì)分光光度法測(cè)定茶葉中游離氨基酸總量的不確定度進(jìn)行了測(cè)量和評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘露茶葉為委托檢樣，產(chǎn)自四川省雅安市蒙頂山。

721分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠，出廠編號(hào)9209Y059，5 mm比色杯。

電子天平，賽多利斯BT125D，出廠編號(hào)22591458。

L-茶氨酸，純度99%，北京百靈威科技有限公司，CAS：3081-61-6。

茚三酮、磷酸氫二鈉等均為分析純。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

樣品試液制備：按GB/T 8314-2013[3]中的規(guī)定，稱(chēng)取3 g(精確至0.001 g)磨碎試樣于500 mL錐形瓶中，加沸蒸餾水450 mL，立即移入沸水浴中，浸提45 min(每隔10 min搖動(dòng)1次)，浸提完畢后立即趁熱減壓過(guò)濾，殘?jiān)蒙倭繜嵴麴s水洗滌2～3次。將濾液轉(zhuǎn)入500 mL容量瓶中，冷卻后用水定容至刻度，搖勻。

樣品測(cè)定：準(zhǔn)確吸取樣品試液1 mL，注入25 mL比色管中，加入0.5 mL pH8.0 磷酸鹽緩沖液和0.5 mL 2% 茚三酮溶液，在沸水浴中加熱15 min，待冷卻后加水定容至25 mL，放置10 min后，用5 mm比色杯，在570 nm處，以試劑空白溶液作參比，測(cè)定吸光度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作：稱(chēng)取250 mg L-茶氨酸溶于適量水中，轉(zhuǎn)移定容至25 mL，搖勻后即得標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。再移取0.0 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別加水定容至50 mL，搖勻后該系列標(biāo)準(zhǔn)工準(zhǔn)液1 mL分別含有0 mg、0.2 mg、0.3 mg、0.4 mg、0.5 mg、0.6 mg茶氨酸。按照樣品測(cè)定方法測(cè)定該系列標(biāo)準(zhǔn)工作液的吸光度，將測(cè)得的吸光度與對(duì)應(yīng)的茶氨酸濃度進(jìn)行計(jì)算，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

最后通過(guò)測(cè)定樣品的吸光值測(cè)得樣品的濃度。

1.3 環(huán)境溫濕度

溫度25±1 ℃，相對(duì)濕度64%。

1.4 計(jì)算方法

X=(C/1000×V1/V2×100%)/(m×w)

式中：X——游離氨基酸總量(%)；

C——根據(jù)測(cè)得的吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查得的茶氨酸毫克數(shù)(mg)；

V1——試液總量(mL)，本實(shí)驗(yàn)中為500 mL；

V2——測(cè)定用試液量(mL)，本實(shí)驗(yàn)中為1 mL；

m——試樣用量(g)；

w——試樣干物質(zhì)含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))(%)。

2 不確定度的來(lái)源分析

從試驗(yàn)過(guò)程和數(shù)學(xué)模型分析，不確定度主要來(lái)源于(1)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及測(cè)定引起的相對(duì)不確定度，其中包括定容標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合等引入的不確定度；(2)樣品制備后定容體積、稱(chēng)量質(zhì)量、干物質(zhì)含量、多次重復(fù)測(cè)量所引入的相對(duì)不確定度；(3)分析儀器的相對(duì)不確定度。其來(lái)源分析詳見(jiàn)表1。

3 不確定度的計(jì)算與評(píng)定

3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及測(cè)定引起的相對(duì)不確定度

3.1.1 配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液引入的相對(duì)不確定度urel(C1)

稱(chēng)取L-茶氨酸(純度不低于99%)250 mg溶于適量水中，轉(zhuǎn)移定容至25 mL，搖勻。該標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL含有10 mg的茶氨酸。

(3)定容25 mL容量瓶，主要涉及體積校準(zhǔn)和水溶液溫度變化兩個(gè)不確定度分量來(lái)源。

表1不確定度的來(lái)源分析

Tab.1 Source analysis of uncertainty

3.1.2 配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液引入的相對(duì)不確定度urel(C2)

移取0.0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別加水定容至50 mL，搖勻，制成系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。再分別吸取1 mL系列標(biāo)準(zhǔn)工作液于一組25 mL比色管中，各加pH8.0磷酸鹽緩沖液0.5 mL和2%茚三酮溶液0.5 mL，在沸水浴中加熱15 min，冷卻后加水定容至25 mL，放置10 min后，用5 mm比色杯，在570 nm處，以試劑空白溶液作參比，測(cè)定吸光度。

配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液過(guò)程中，使用到1 mL移液管A級(jí)、50 mL容量瓶A級(jí)、25 mL比色管，其各自的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算原理與3.1.1(3)相同。

3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合引入的相對(duì)不確定度urel(Q)

用721分光光度計(jì)測(cè)定所配制的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的吸光度，每個(gè)濃度測(cè)定兩次，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2標(biāo)準(zhǔn)工作溶液吸光度

Tab.2 Absorbance of standard work solution

根據(jù)平均吸光度計(jì)算得出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為：y=1.375x-0.104，其中斜率b=1.375，截距a=-0.104，相關(guān)系數(shù)R2=0.999。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)數(shù)據(jù)如下，見(jiàn)表3。

表3標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)數(shù)據(jù)

Tab.3 Standard curve data

n：測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)溶液的次數(shù)，n=6×2=12；

p：測(cè)試樣品的次數(shù)，p=4；

b：工作曲線(xiàn)的斜率，b=1.375；

j：下標(biāo)，測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)溶液的次數(shù)。

3.2 樣品定容體積、稱(chēng)樣質(zhì)量、重復(fù)測(cè)定所引入的相對(duì)不確定度

3.2.1 樣品處理過(guò)程中定容體積的相對(duì)不確定度urel(V)

樣品經(jīng)前處理后的濾液用500 mL的A級(jí)容量瓶進(jìn)行定容，再分別吸取1 mL定容濾液于一組25 mL比色管中，各加pH8.0磷酸鹽緩沖液0.5 mL和2%茚三酮溶液0.5 mL，在沸水浴中加熱15 min，冷卻后加水定容至25 mL，放置10 min后，用5 mm比色杯，在570 nm處，以試劑空白溶液作參比，測(cè)定吸光度。

定容500 mL容量瓶、移取1 mL濾液和最后定容于25 mL比色管中，均涉及體積校準(zhǔn)、水溶液溫度變化兩個(gè)不確定度分量來(lái)源。計(jì)算原理同3.1.2。

(2)根據(jù)3.1.2的計(jì)算可知，1mL移液管的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(v2′)=4.66×10-3。

(3)根據(jù)3.1.2的計(jì)算可知，25mL比色管的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(v3′)= 5.79×10-3。

3.2.2 樣品稱(chēng)量產(chǎn)生的相對(duì)不確定度urel(M)

3.2.3 樣品重復(fù)性測(cè)量的相對(duì)不確定度urel(X)

實(shí)際測(cè)定樣品溶液4次，茶葉中游離氨基酸總量平行測(cè)試的結(jié)果(%)見(jiàn)表4和表5。

表4樣品實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)

Tab.4 Sample measured data

表5樣品游離氨基酸含量平行測(cè)試結(jié)果

Tab.5Paralleltestresultsoffreeaminoacidcontentinsamples

nxi(%)︱xi-x︱(xi-x)216.65200.00287.84×10-626.64820.00101.0×10-636.64450.004722.09×10-646.65200.00287.84×10-6x(%)6.6492

實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差根據(jù)貝塞爾公式有：

重復(fù)性測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

3.3 樣品干物質(zhì)含量測(cè)定引入的相對(duì)不確定度urel(W)

包含樣品干物質(zhì)重復(fù)性測(cè)量的相對(duì)不確定度urel(r)和干物質(zhì)稱(chēng)量產(chǎn)生的相對(duì)不確定度urel(w1)，同時(shí)要考慮恒重問(wèn)題。

表6干物質(zhì)含量測(cè)量數(shù)據(jù)

Tab.6Measurementdataofdrymattercontent

空皿恒重質(zhì)量(g)樣品的質(zhì)量(g)烘干后的空皿和樣品恒重質(zhì)量(g)干物質(zhì)含量(%)32.44605.009937.223395.3632.31784.995637.075195.23干物質(zhì)平均含量(%)95.295

3.3.1 樣品重復(fù)性測(cè)量的相對(duì)不確定度urel(r)

根據(jù)GB/T 8314-2013[3]的要求，樣品干物質(zhì)獨(dú)立測(cè)量?jī)纱危瑒t測(cè)量重復(fù)性的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差為

=0.0919 %

樣品干物質(zhì)平均含量為95.295 %，則重復(fù)性的相對(duì)不確定度urel(r)=0.065%/95.295%=6.82×10-4。

3.3.2 干物質(zhì)稱(chēng)量產(chǎn)生的相對(duì)不確定度urel(w1)

干物質(zhì)測(cè)定中包含3次稱(chēng)量，分別是干燥前稱(chēng)量皿恒重稱(chēng)量，樣品稱(chēng)量，干燥后稱(chēng)量皿與樣品恒重稱(chēng)量。

稱(chēng)量皿平均質(zhì)量為32.3819 g，urel(m1)=1.151×10-3g/32.3819 g=3.55×10-5。

(2)樣品稱(chēng)量只與天平秤量有關(guān)，故u(m2)= u(m0)=5.77×10-5g。

樣品干物質(zhì)平均稱(chēng)樣量為5.00275 g，則天平稱(chēng)重的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

urel(m2)=5.77×10-5g/5.00275 g=1.15×10-5

(3)干燥后稱(chēng)量皿與樣品恒重，涉及了天平秤量和恒重，故u(m3)= u(m1)=1.151×10-3g。

干燥后稱(chēng)量皿與樣品平均質(zhì)量為37.1492g，urel(m3)=1.151×10-3g/37.1492 g =3.1×10-5。

綜合4.4.1和4.4.2，樣品干物質(zhì)含量測(cè)定引入的相對(duì)不確定度

=6.84×10-5。

3.4 分析儀器的相對(duì)不確定度urel(J)

721分光光度計(jì)的校準(zhǔn)證書(shū)上提供了透射比示值誤差測(cè)量結(jié)果不確定度可見(jiàn)光段Urel=0.6%，k=2，則urel(J)=0.6%/2=0.3%=3.0×10-3。

4 合成相對(duì)不確定度

根據(jù)表7，合成相對(duì)不確定度。

表7不確定度總覽表

Tab.7 The uncertainty of the list

合成相對(duì)不確定度的計(jì)算如下：

5 相對(duì)擴(kuò)展不確定度評(píng)估

取置信概率p=95%，且取擴(kuò)展因子k=2，則相對(duì)擴(kuò)展不確定度為Urel=1.6×10-2×2=3.2×10-2。

6 結(jié)論

本文對(duì)GB/T 8314-2013茶 游離氨基酸總量的測(cè)定過(guò)程做了詳細(xì)的測(cè)量不確定度評(píng)估，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合是關(guān)鍵步驟，其相對(duì)不確定度分量達(dá)到1.17×10-2，將會(huì)對(duì)茶葉游離氨基酸總量的測(cè)定產(chǎn)生顯著影響，故在測(cè)定時(shí)應(yīng)對(duì)其重點(diǎn)控制，這對(duì)提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性有重要的參考意義。

本次實(shí)驗(yàn)所測(cè)的游離氨基酸總量為6.6492%，修約后為6.6%，Urel=3.2×10-2，k=2，p=95%。