袁 川，吳 南，劉應(yīng)高，許秀蘭，趙景陽(yáng)，李萬(wàn)艷

(1．廣安市林業(yè)技術(shù)推廣站，四川 廣安 638000；2．四川省林業(yè)有害生物防治協(xié)會(huì)，四川 成都 610081；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院， 四川 成都 611130)

由枯斑擬盤多毛孢(PestalotiapsisfunereaDesm.)引起的松赤枯病是松樹幼齡林上常見(jiàn)的病害，分布廣、危害嚴(yán)重。該病在四川自1974年開始發(fā)生危害，到1980年流行以來(lái)，已成為主要針葉林木病害，居林木病害首位[1～4]。目前對(duì)松赤枯病的檢測(cè)主要是在病害表現(xiàn)出一定的癥狀之后，通過(guò)癥狀觀察，用組織分離的方法，以“形態(tài)結(jié)構(gòu)特征為主、生理生化、細(xì)胞化學(xué)和生態(tài)特征為輔”的分類原則進(jìn)行鑒定[5]，但這種方法耗時(shí)耗材，并且病害表現(xiàn)出癥狀后就已經(jīng)給林木造成危害，不利于病害的早期診斷與防控。

利用病原菌在rDNA的ITS區(qū)段既具保守性，又在科、屬、種水平上均有序列多態(tài)性，對(duì)ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序及序列分析后再設(shè)計(jì)特異引物來(lái)診斷和檢測(cè)植物病原菌，尤其是植物病原真菌的分子檢測(cè)已越來(lái)越被廣泛應(yīng)用[6～8]。依據(jù)真菌種內(nèi)ITS區(qū)保守序列設(shè)計(jì)引物可實(shí)現(xiàn)對(duì)該種真菌在患病植物體內(nèi)的特異性擴(kuò)增。

本研究為提高松赤枯病的檢測(cè)效率，通過(guò)針對(duì)枯斑擬盤多毛孢設(shè)計(jì)特異性引物與待測(cè)松樹基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，在松赤枯病癥狀出現(xiàn)前檢測(cè)出病原物的有無(wú)，為該病害的早期防治提供依據(jù)，以達(dá)到提前預(yù)防該病害的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

供試菌株由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林保護(hù)實(shí)驗(yàn)室提供，陽(yáng)性對(duì)照為枯斑擬盤多毛孢菌株；陰性對(duì)照為星形擬盤多毛孢、散沫擬盤多毛孢、針葉散斑殼、松針散斑殼、尖孢鐮刀菌株。

表1供試菌株一覽表

1.1.2 樣本采集與處理

于2015年9月至2016年8月，對(duì)四川瀘定二郎山林場(chǎng)和成都蒲江縣石象湖馬尾松林中隨機(jī)選擇4—5個(gè)樣地中的高山松(Pinus.densataMast)、華山松(P.armandiiFranch.)、云南松(P.yunnanensisFranch)、馬尾松(P.massoniana)的1年生針葉共計(jì)進(jìn)行9次采樣。采得樣本按葉尖、葉中和葉基分成3段，經(jīng)75%的酒精表面消毒處理后，保存于-70 ℃的冰箱備用。

1.1.3 試驗(yàn)試劑

植物基因組DNA提取試劑盒(DP305)、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000、PCR反應(yīng)試劑(北京天根生化科技有限公司)，瓊脂糖(北京賽百勝基因技術(shù)有限公司)。

1.2 試驗(yàn)儀器

5804R冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，iCycler-PCR擴(kuò)增儀、Sub-Cell水平電泳儀、Gel DocTM XR凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)，電熱恒溫水浴鍋(天津民利科學(xué)器材廠)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 松針基因組DNA和菌絲DNA的提取

利用天根植物組DNA提取試劑盒提取松針與菌絲基因組DNA，操作步驟見(jiàn)說(shuō)明書。DNA提取物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性后，于紫外分光度計(jì)檢測(cè)濃度，并用buff TE稀釋至終濃度為1 μg·μL-1，-20℃保存待用。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與合成

從Genbank庫(kù)中查找下載枯斑擬盤多毛孢的DNA ITS區(qū)序列及同屬其他菌種同源基因，用Clustal進(jìn)行多序列比對(duì)，DNA Star根據(jù)差異位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)出AF，GQ-1,GQ-2,GQ-3四對(duì)引物。委托北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行引物AF，GQ-1,GQ-2,GQ-3與在已發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)中選取的3對(duì)引物(ITS4-ITS5[10]，LROR-LR5[11]，LR3R-LR3[11])的合成。

表2枯斑擬盤多毛孢菌的7對(duì)PCR引物序列

1.3.3 rDNA-ITS擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序

以所提松針基因組DNA作為模板，使用1.3.2所設(shè)計(jì)合成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系50 μL：5μL松針基因組DNA原液，25 μLPremix，上下游引物各2 μL(10 μmol·L-1)，用ddH2O補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)在iCycler-PCR儀上進(jìn)行，程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，10 ℃保存[9]。取5 μL PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠100 V下電泳20 min，260 nm紫外燈下觀察并照相。將條帶清晰的PCR產(chǎn)物送往北京六合華大基因科技股份有限公司純化測(cè)序。參考Genbank庫(kù)中枯斑擬盤多毛孢序列并與測(cè)序結(jié)果進(jìn)行blastn比對(duì)，以確定擴(kuò)增產(chǎn)物是否為枯斑擬盤多毛孢。

1.3.4 特異性檢測(cè)

以枯斑擬盤多毛孢菌株為陽(yáng)性對(duì)照，星形擬盤多毛孢、散沫擬盤多毛孢、針葉散斑殼、松針散斑殼、尖孢鐮刀菌株為陰性對(duì)照，ddH2O為空白對(duì)照，采用1.3.2所述引物對(duì)，按照1.3.3的反應(yīng)體系進(jìn)行特異性檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選與擴(kuò)增結(jié)果驗(yàn)證驗(yàn)證

據(jù)Genbank庫(kù)中枯斑擬盤多毛孢的ITS區(qū)序列，采用DNAStar工具共設(shè)計(jì)引物8對(duì)，使用BLAST軟件驗(yàn)證引物特異性，篩選出4對(duì)(AF，GQ-1,GQ-2,GQ-3)，在已發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)中選取引物3對(duì)(ITS4-ITS5[10]，LROR-LR5[11]，LR3R-LR3[11])，分別對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的枯斑擬盤多毛孢的菌絲DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 7對(duì)引物擴(kuò)增枯斑擬盤多毛孢菌絲DNA的電泳圖譜M：DL2000 Marker；1：AF；2：GQ-1；3：GQ-2；4：GQ-3；5：ITS4-ITS5；6：LROR-LR5；7：LR3R-LR3

從圖1可以看出，引物AF條帶明亮、且無(wú)雜帶，滿足特異擴(kuò)增的要求。

使用引物AF對(duì)枯斑擬盤多毛孢和實(shí)驗(yàn)室存有的已報(bào)道過(guò)的其它樹棲真菌菌絲DNA同時(shí)進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 AF引物擴(kuò)增幾種樹棲真菌菌絲DNA的電泳圖譜M：DL2000 Marker；1：枯斑擬盤多毛孢；2：CK(空白)；3：星形擬盤多毛孢；4：散沫擬盤多毛孢；5：針葉樹散斑殼；6：松針散斑殼；7：尖孢鐮刀菌

從圖2可以看出，陽(yáng)性樣品枯斑擬盤多毛孢條帶明亮、且無(wú)雜帶，陰性樣品及空白對(duì)照條帶較暗或無(wú)條帶，表明引物AF對(duì)枯斑擬盤多毛孢具有較強(qiáng)的特異性。

2.2 PCR反應(yīng)及電泳結(jié)果

試驗(yàn)共采樣9次，每次的樣品DNA分別進(jìn)行PCR反應(yīng)及電泳檢測(cè)后，華山松、高山松針葉的電泳圖無(wú)條帶，結(jié)果表明，華山松、高山松針葉上全年均沒(méi)有檢測(cè)到松赤枯病病原菌。在2016年3月前采集的馬尾松、云南松針葉樣品的電泳圖無(wú)條帶，結(jié)果表明，在2016年3月前采集的馬尾松、云南松針葉上均沒(méi)有檢測(cè)到松赤枯病病原菌。

將2016年3月在蒲江石象湖采集的馬尾松針葉DNA，按葉尖、葉中、葉基分別發(fā)生PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 馬尾松赤枯病1號(hào)樣地2016年3月檢測(cè)結(jié)果圖M：DL2000 Marker；1-3：松針尖部；4-6：松針中部；7-9：松針基部

結(jié)果表明，2016年3月在蒲江石象湖采集的馬尾松松針尖部，首先檢測(cè)到侵染針葉的枯斑擬盤多毛孢，而針葉中部、基部均沒(méi)有檢測(cè)到枯斑擬盤多毛孢。

將2016年3月在瀘定二郎山采集的云南松針葉DNA，按葉尖、葉中、葉基分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 云南松赤枯病2016年3月檢測(cè)結(jié)果圖M：DL2000 Marker；1-3：松針尖部；4-6：松針中部；7-9：松針基部

結(jié)果表明，2016年3月在瀘定二郎山采集的云南松松針尖部、中部，首先檢測(cè)到侵染針葉的枯斑擬盤但電泳圖譜中針葉中部條帶較暗，無(wú)法測(cè)序，而針葉基部沒(méi)有檢測(cè)到枯斑擬盤多毛孢。

將2016年5月在瀘定二郎山采集的云南松針葉DNA，按葉尖、葉中、葉基分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 云南松赤枯病2016年5月檢測(cè)效果圖M：DL2000 Marker；1-3：松針尖部；4-6：松針中部；7-9：松針基部

結(jié)果表明，2016年5月在瀘定二郎山采集的侵染云南松的枯斑擬盤多毛孢在其針葉尖部、中部均被檢測(cè)出來(lái)，電泳條帶明顯比3月時(shí)更明亮，針葉基部仍沒(méi)有檢測(cè)到枯斑擬盤多毛孢。

將2016年6月在瀘定二郎山采集的云南松針葉DNA，按葉尖、葉中、葉基分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 云南松赤枯病2016年6月檢測(cè)結(jié)果圖M：DL2000 Marker；1-3：松針尖部；4-6：松針中部；7-9：松針基部

結(jié)果表明，2016年6月在瀘定二郎山采集的云南松的枯斑擬盤多毛孢在其針葉尖部、中部、基部均被檢測(cè)出來(lái)，電泳條帶除針葉基部略暗外，針葉尖部、中部都比較明亮。

2.3 測(cè)序及序列比對(duì)

條帶明亮的PCR產(chǎn)物由北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序，測(cè)序樣品共15個(gè)，共得到8條理想的序列，在Genbank中與已注冊(cè)的枯斑擬盤多毛孢序列AF405299.1、GQ412730.1經(jīng)BLAST比對(duì)后[12]，相似度均高達(dá)97%～99%，并得到了枯斑擬盤多毛孢的ITS1和ITS2區(qū)序列，可以確定枯斑擬盤多毛孢侵染了馬尾松、云南松針葉。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

試驗(yàn)表明，根據(jù)Genbank庫(kù)已有的枯斑擬盤多毛孢序列，通過(guò)其ITS區(qū)序列設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)松針基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法來(lái)檢測(cè)處于潛伏期的枯斑擬盤多毛孢是可行的。使用這種方法可以提前兩個(gè)月檢測(cè)出松赤枯病病原，為病害防治爭(zhēng)取了時(shí)間，同時(shí)也可以為病原真菌大規(guī)模的分類鑒定及分子檢測(cè)工作提供參考。

3.2 討論

從2016年3月開始檢測(cè)到枯斑擬盤多毛孢，這是因?yàn)榇藭r(shí)正是枯斑擬盤多毛孢以分生孢子和菌絲體在松樹病葉中越冬完畢，在春季到來(lái)氣候適宜時(shí)開始大量生長(zhǎng)傳播[13,14]，當(dāng)新生針葉處于速生期，此時(shí)葉表皮細(xì)胞未全部角質(zhì)化，抗逆能力差，病害便相繼發(fā)生[15]。隨著時(shí)間的推移，該菌在針葉上的量也增加，此時(shí)從松針中提取到的枯斑擬盤多毛孢DNA相比之前也大量增加，故檢測(cè)結(jié)果也逐漸明顯。

實(shí)驗(yàn)最先在松針尖部檢測(cè)到枯斑擬盤多毛孢，可以初步判定該菌先從針葉尖部侵染松針，這是因?yàn)樗舍樇獠肯鄬?duì)中部、基部而言，自然孔口更大，同時(shí)也相對(duì)柔嫩容易受傷，而枯斑擬盤多毛孢侵染松針的時(shí)候，是從自然孔口或傷口侵入[16]，所以松針尖部相對(duì)更易被病菌侵染。

植物病原真菌的檢測(cè)鑒定大多采用傳統(tǒng)方法，即分離培養(yǎng)、顯微鏡觀察形態(tài)及簡(jiǎn)單的生理性狀測(cè)定等，但由于這種以形態(tài)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的鑒定方法往往會(huì)受到人為因素和環(huán)境條件干擾，許多子實(shí)體類型經(jīng)常難以獲得，給鑒定工作帶來(lái)困難，而且耗時(shí)長(zhǎng)、不適合快速鑒定的要求。而常見(jiàn)的利用ITS序列來(lái)檢測(cè)植物真菌病害主要是先分離得到純培養(yǎng)的病原菌菌株，進(jìn)而得到其菌絲DNA，再利用通過(guò)引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出病原菌的ITS區(qū)序列，針對(duì)ITS序列設(shè)計(jì)特異性引物來(lái)對(duì)植物真菌病害進(jìn)行分子檢測(cè)[17～19]。本研究立足于前人的研究成果，直接從植物組織中提取植物組織基因組DNA，通過(guò)在Genbank庫(kù)中查詢已報(bào)道過(guò)的病原菌序列，通過(guò)分析該序列并設(shè)計(jì)特異性引物，然后對(duì)整個(gè)植物組織基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出植物組織中可能含有的病原菌的ITS序列，達(dá)到檢測(cè)病害的目的。相對(duì)而言，這種方法更省時(shí)、高效，節(jié)約了病害檢測(cè)的時(shí)間和成本，有利于大規(guī)模的推廣應(yīng)用。