陳淑亞 福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司 福州 350014

細(xì)胞是生命體的組成和架構(gòu)的最小單位，是生命科學(xué)研究的重要工具。細(xì)胞培養(yǎng)廣泛地應(yīng)用于生物工程領(lǐng)域例如病毒的分離、鑒定，疫苗制備以及篩選各類毒株[1]。隨著生物學(xué)研究工作的發(fā)展，雞胚成纖維細(xì)胞應(yīng)用越來越廣泛。因?yàn)殡u胚成纖維細(xì)胞來源方便，適應(yīng)能力強(qiáng)，繁殖快，耐受性良好等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物制品領(lǐng)域，比如病毒培養(yǎng)、疫苗制備、各實(shí)驗(yàn)室的基礎(chǔ)細(xì)胞等。因此雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)工作越來越受到重視，采用不同廠家生產(chǎn)的胰酶對(duì)SPF雞胚進(jìn)行消化培養(yǎng)，通過活細(xì)胞計(jì)數(shù)和貼壁培養(yǎng)觀察細(xì)胞的生長情況[2]。

1 材 料

1.1 試驗(yàn)材料及其他 雞胚：9～11日齡SPF雞胚購于濟(jì)南斯帕斯家禽有限公司。主要器械：吸管、平皿、T25方瓶、眼科鑷、眼科剪、鑷子、蛋托、搪瓷罐、水浴鍋、倒置顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱、三角瓶、帶有過濾紗布（6層）的漏斗、血球計(jì)數(shù)板、1 000 μL移液槍、廢液罐等。

1.2 主要試劑、溶液 新生牛血清：購自蘭州榮曄生物科技有限責(zé)任公司。胰酶：Difco胰酶，購自美國碧迪醫(yī)療器械有限公司；Gibco胰酶，購自Life Technologies Corporation。染色液：1%中性紅染液?？咕兀好亢辽?0 000單位青霉素和慶大硫酸霉素。堿：5.6%碳酸氫鈉溶液。營養(yǎng)液：0.5%乳漢液。洗滌液：漢克氏液。溶液均為自配，經(jīng)過高壓滅菌或者濾過除菌，經(jīng)無菌檢驗(yàn)合格后放入冷凍或2～8℃冰箱備用。

2 方 法

2.1 操作前準(zhǔn)備 開啟凈化工作臺(tái)，將需要預(yù)熱的液體放置在37℃水浴鍋中預(yù)熱。

2.2 雞胚的處理 取9～11日齡SPF雞胚于超凈工作臺(tái)上，用碘酒棉對(duì)雞胚氣室部位進(jìn)行消毒，然后用無菌鑷子把氣室部位的蛋殼敲破，沿氣室部位夾去蛋殼，用眼科鑷挑破殼膜和囊膜，夾出雞胚放在平皿里[3]；用眼科鑷剔除雞胚的眼睛、腦部，用漢克氏液清洗2次，把清洗后的雞胚移入搪瓷罐內(nèi)，用眼科剪將雞胚剪成米粒大小 （1～2 mm3）[3]， 把雞胚等量移入2個(gè)100 mL錐形瓶中，并標(biāo)號(hào)瓶1和瓶2，分別加入漢克氏液，混勻，靜置使組織塊下沉，棄去上清液，如此反復(fù)2次。

2.3 胰蛋白酶消化 將預(yù)熱好的Difco胰酶溶液和Gibco胰酶溶液分別加入裝有組織塊的錐形瓶1和瓶2中，其中瓶1中加入的是由Difco廠家生產(chǎn)的胰酶，瓶2中加入由Gibco廠家生產(chǎn)的胰酶，并把2個(gè)三角瓶同時(shí)放入37℃水浴鍋中，每隔10 min輕輕搖勻1次，使細(xì)胞消化均勻。消化30 min后，待組織塊出現(xiàn)散松、絨毛狀時(shí)取出錐形瓶1和瓶2，棄去胰酶溶液，迅速加入含有血清的乳漢液，靜置數(shù)秒，棄去上清液。

2.4 細(xì)胞制備 將含有血清的乳漢液加入消化好的錐形瓶1和瓶2，并用高壓過的無菌吸管多次吹吸，靜置數(shù)分鐘，使組織塊下沉，用吸管吸出細(xì)胞懸液于2個(gè)100 mL干凈玻璃瓶內(nèi)，重復(fù)此操作，直至組織塊發(fā)白、液體清亮為止。并用6層紗布過濾細(xì)胞懸液，除去雜質(zhì)。

2.5 細(xì)胞計(jì)數(shù) 取1 mL細(xì)胞懸液，4 mL營養(yǎng)液并加入數(shù)滴1%臺(tái)盼蘭，充分混合，室溫下靜置5 min。用移液槍取少許細(xì)胞懸液滴在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，在倒置顯微鏡下觀察，按白細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)算出每毫升中細(xì)胞數(shù)[4]。

2.6 細(xì)胞培養(yǎng)觀察 將計(jì)數(shù)好的的細(xì)胞懸液1和細(xì)胞懸液2，等量分裝于4個(gè)T25方瓶中，并做好標(biāo)記（1-1、1-2、2-1、2-2），放入 CO2培養(yǎng)箱中 37 ℃培養(yǎng)。每天應(yīng)定時(shí)觀察，留意細(xì)胞生長情況，如有無污染、形態(tài)大小、生長狀態(tài)等，并做好記錄。

3 結(jié)果與分析

3.1 消化過程對(duì)比 在消化過程中，用Difco廠家生產(chǎn)的胰酶瓶1的胚體，在消化至28 min后有明顯膨大疏松，邊緣絨毛出現(xiàn)；Gibco廠家生產(chǎn)的胰酶瓶2在消化32 min后，胚體才出現(xiàn)類似情況。

3.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)對(duì)比 同一時(shí)間內(nèi)，2種胰酶溶液消化制備的細(xì)胞計(jì)數(shù)情況見表1。從表中可知：在相同的消化時(shí)間下，2種胰酶消化雞胚制備的懸液細(xì)胞數(shù)，Difco廠家生產(chǎn)的胰酶略高于Gibco廠家生產(chǎn)的胰酶。

表1 細(xì)胞計(jì)數(shù)比對(duì)

3.3 培養(yǎng)過程觀察 在CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h后，通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況及狀態(tài)。2組細(xì)胞貼壁情況良好，生長狀態(tài)旺盛，細(xì)胞在培養(yǎng)24 h后都明顯形成致密單層；細(xì)胞生長情況良好，細(xì)胞透明，細(xì)胞質(zhì)突起，細(xì)胞中央有卵圓形核，整個(gè)形態(tài)呈長梭形，細(xì)胞已呈纖維樣形態(tài)。但細(xì)胞在貼壁過程中，使用Gibco胰酶消化液制備的雞胚成纖維細(xì)胞已形成致密的單層，很難從形態(tài)上辨別纖維樣形態(tài)（見圖1A）；使用Difco胰酶消化液制備的細(xì)胞能辨別出明顯的纖維狀，呈單個(gè)個(gè)體較多 （見圖1B）。

圖1 2種胰酶消化液制備的雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)24 h生長狀態(tài)

4 討 論

雞胚成纖維細(xì)胞，因具有操作簡便、適應(yīng)能力強(qiáng)、增殖快、耐受性良好等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物制品領(lǐng)域的研究與生產(chǎn)。試驗(yàn)中選用的2種不同廠家生產(chǎn)的胰酶，首先是在各實(shí)驗(yàn)室和生物制品公司應(yīng)用比較廣泛，其次是想對(duì)比一下不同廠家生產(chǎn)的胰酶存在的差異性。

從整個(gè)試驗(yàn)過程以及細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果來看，在相同條件下，2種胰酶對(duì)組織塊的消化作用不盡相同。在同等溫度、消化時(shí)間時(shí)，Difco廠家生產(chǎn)的胰酶對(duì)雞胚的消化作用強(qiáng)于Gibco廠家生產(chǎn)的胰酶。

在細(xì)胞的制備過程中，反復(fù)吹吸后靜置時(shí)，用Difco廠家生產(chǎn)的胰酶消化的雞胚，比較緩慢呈懸浮的狀態(tài)在細(xì)胞懸液中，且在最后洗吸中，胚體也易被洗吹成“粉末”，因此，在細(xì)胞吹吸過程中，應(yīng)控制吹吸的力度和次數(shù)。