謝文敏

【摘要】目的：通過(guò)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法構(gòu)建對(duì)大鼠血漿中紫杉醇濃度的檢測(cè)。方法：使用克拉霉素溶液作為內(nèi)標(biāo)物，大鼠血漿樣品通過(guò)乙腈溶液處理后，進(jìn)行HPLC-MS檢測(cè)。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（簡(jiǎn)稱為HPLC-MS）對(duì)血漿中紫杉醇濃度進(jìn)行檢測(cè)，具有檢測(cè)速度快、檢測(cè)靈敏度高的特點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)臨床治療過(guò)程中的檢測(cè)要求。

【關(guān)鍵詞】紫杉醇;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

【中圖分類號(hào)】R123【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】2095-6851（2019）06-252-01

0 引言

紫杉醇，又叫泰素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)在1971年被確定，是一種四環(huán)二萜類化合物。它是一種良好的抗腫瘤藥物，當(dāng)腫瘤細(xì)胞發(fā)生分裂時(shí)，它可以和微觀蛋白發(fā)生聚合作用，從而阻礙腫瘤細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂的過(guò)程，使得腫瘤細(xì)胞停止生長(zhǎng)。通過(guò)相關(guān)的臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，紫杉醇在許多腫瘤類疾病，例如：卵巢腫瘤、乳腺腫瘤、肺部腫瘤、淋巴腫瘤等，具有一定的治療效果。因此，對(duì)血漿中紫杉醇濃度進(jìn)行檢測(cè)這一項(xiàng)目有著重要的現(xiàn)實(shí)意義[1]。

通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)調(diào)研，我們藥廠發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)外科研工作者主要利用反相高效液相色譜法對(duì)血漿中紫杉醇濃度進(jìn)行檢測(cè)，但是反相高效液相色譜法存在對(duì)樣品檢測(cè)的靈敏度較低、操作流程不簡(jiǎn)潔以及檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)等問(wèn)題[2-3]。因此，我們藥廠利用了一種檢測(cè)速度快、檢測(cè)靈敏度高的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（簡(jiǎn)稱為HPLC-MS）對(duì)血漿中紫杉醇濃度進(jìn)行檢測(cè)，現(xiàn)給出我們藥廠的檢測(cè)報(bào)告如下：

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藥品

我們藥廠以對(duì)照品紫杉醇，其含量為99.5%作為檢測(cè)試樣;以對(duì)照品克拉霉素，其含量為99.9%作為內(nèi)標(biāo)物。其他全部藥品為分析純。

1.2 儀器

我們藥廠采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，具體型號(hào)為Agilent 1100 LC/MSD SL，同時(shí)，為這臺(tái)儀器配置電噴霧離子化電離源（ESI）;還采用高溫低速離心機(jī)，具體型號(hào)為Eppendorf 5427 R，來(lái)自于美國(guó)Eppendorf公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

我們藥廠利用四只雄性的大鼠作為研究對(duì)象，大鼠均來(lái)自于動(dòng)物繁殖場(chǎng)，大鼠質(zhì)量約為（230 ± 20）克。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

高效液相色譜的色譜柱為2.1毫米 × 150毫米，5微米;高效液相色譜的流動(dòng)相為甲醇和0.05%甲酸水溶液，其體積比為70 ： 30;高效液相色譜的流動(dòng)速度為每分鐘0.2毫升;高效液相色譜的柱溫為25 ℃。

2.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜法所采用的離子源為電噴霧離子化電離源（ESI），其中霧化氣壓為20 Pa，氣體流動(dòng)速度為每分鐘10.0毫升，溫度為350 ℃。通過(guò)正離子的方式檢測(cè)，從理論上來(lái)說(shuō)，紫杉醇的質(zhì)譜數(shù)據(jù)為 m/z = 876.5 [M + Na]+，而克拉霉素的質(zhì)譜數(shù)據(jù)為m/z = 748.6 [M + H]+。

2.3 大鼠血漿樣品的處理

我們量取0.2毫升的大鼠血漿，向其中加入10微升的內(nèi)標(biāo)物克拉霉素溶液，將兩者混合均勻;再向其中加入4毫升的乙腈溶液，振蕩1.5分鐘，然后靜置;通過(guò)高速離心機(jī)離心10分鐘，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為每分鐘2000轉(zhuǎn);隨后取上層清澈液體20微升，加入到高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀器中進(jìn)行檢測(cè)。

2.4 質(zhì)譜分析

質(zhì)譜儀通過(guò)正離子的方式檢測(cè)的情況下，紫杉醇通常會(huì)產(chǎn)生[M + Na]+的分子離子峰，質(zhì)譜數(shù)據(jù)為 m/z = 876.5;內(nèi)標(biāo)物克拉霉素通常會(huì)產(chǎn)生[M + H]+ 的分子離子峰，質(zhì)譜數(shù)據(jù)為 m/z = 748.6，因此在對(duì)樣品做定量分析時(shí)，我們要選擇性檢測(cè)出上述分子離子峰。

2.5 方法學(xué)研究

2.5.1 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液 對(duì)于紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制，首先，使用精密度較高的分析天平稱量0.0120克紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，將其溶解在甲醇溶液中，再使用10毫升的容量瓶對(duì)上述溶液進(jìn)行定容。當(dāng)進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以通過(guò)將上述溶液稀釋成不同濃度來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

對(duì)于內(nèi)標(biāo)物克拉霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制，首先，使用精密度較高的分析天平稱量0.0121克克拉霉素內(nèi)標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，將其溶解在甲醇溶液中，再使用10毫升的容量瓶對(duì)上述溶液進(jìn)行定容。當(dāng)進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以通過(guò)將上述溶液稀釋成不同濃度來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.5.2 方法專屬性

量取0.2毫升的大鼠血漿，向其中加入4毫升的乙腈溶液，振蕩1.5分鐘，然后靜置;通過(guò)高速離心機(jī)離心10分鐘，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為每分鐘2000轉(zhuǎn);隨后取上層清澈液體20微升，加入到高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀器中進(jìn)行檢測(cè)。

量取0.18毫升的大鼠血漿，向其中加入10微升的內(nèi)標(biāo)物克拉霉素溶液和20微升的一定濃度的紫杉醇溶液，將兩者混合均勻;再向其中加入4毫升的乙腈溶液，振蕩1.5分鐘，然后靜置;通過(guò)高速離心機(jī)離心10分鐘，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為每分鐘2000轉(zhuǎn);隨后取上層清澈液體20微升，加入到高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀器中進(jìn)行檢測(cè)。

上述結(jié)果表明，紫杉醇的保留時(shí)間為2.0分鐘，而克拉霉素的保留時(shí)間為2.5分鐘，與此同時(shí)，在空白血漿的樣品中，其內(nèi)源性物質(zhì)不影響實(shí)驗(yàn)的測(cè)試結(jié)果，包括紫杉醇的保留時(shí)間與克拉霉素的保留時(shí)間測(cè)定。這樣的結(jié)果表明，該方法有比較高的專屬性。

2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

量取0.18毫升的大鼠血漿，向其中加入10微升的內(nèi)標(biāo)物克拉霉素溶液和20微升的一定濃度的紫杉醇溶液，其中選取的紫杉醇濃度分別為每毫升7.5納克， 15.0納克， 60.0納克， 150.0納克， 300.0納克， 600.0納克， 1200.0納克， 6000.0納克），向其中加入4毫升的乙腈溶液，振蕩1.5分鐘，然后靜置;通過(guò)高速離心機(jī)離心10分鐘，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為每分鐘2000轉(zhuǎn);隨后取上層清澈液體20微升，加入到高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀器中進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)色譜圖進(jìn)行記錄，繪制出檢測(cè)物濃度（以此為橫坐標(biāo)）與檢測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值（以此為縱坐標(biāo)）的曲線圖，通過(guò)最小二乘法對(duì)上述數(shù)據(jù)使用回歸計(jì)算，得到的線性回歸方程為 Y = 1.7089 C + 0.0069，其中相關(guān)系數(shù)r = 0.9999，對(duì)應(yīng)獲得的紫杉醇的線性范圍在7.5到6000.0 納克/毫升之間，定量限在7.5納克/毫升。

2.5.4 回收率及精密度檢測(cè)

量取大鼠血漿，向其中加入一定量紫杉醇溶液，配制成多份濃度為15納克/毫升、300納克/毫升、6000納克/毫升的紫杉醇血漿溶液，再向其中加入10微升的內(nèi)標(biāo)物克拉霉素溶液，將兩者混合均勻;再向其中加入4毫升的乙腈溶液，振蕩1.5分鐘，然后靜置;通過(guò)高速離心機(jī)離心10分鐘，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為每分鐘2000轉(zhuǎn);隨后取上層清澈液體20微升，加入到高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀器中進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)任意標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回收率。每天平行做五次實(shí)驗(yàn)，隔一天再平行做5次實(shí)驗(yàn)，將其統(tǒng)計(jì)為日內(nèi)精密度與日間精密度和回收率，見(jiàn)表1所示。

2.5.5 穩(wěn)定性檢測(cè)

對(duì)于溶液的穩(wěn)定性來(lái)說(shuō)，選取相同的溶液進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間分別為直接檢測(cè)、一小時(shí)、四小時(shí)、八小時(shí)、十二小時(shí)與二十四小時(shí)，對(duì)溶液血漿濃度進(jìn)行計(jì)算，RSD的數(shù)值為1.01%，表明在二十四小時(shí)以內(nèi)該溶液處于穩(wěn)定狀態(tài)。

對(duì)于溶液的冷融穩(wěn)定性來(lái)說(shuō)，選取三個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，其濃度分別為低濃度、中濃度和高濃度，把三個(gè)樣品放置于零下20 ℃中，檢測(cè)時(shí)間分別為直接檢測(cè)、一天、三天、七天與十四天，對(duì)溶液血漿濃度進(jìn)行計(jì)算，得到的低濃度、中濃度和高濃度的RSD的數(shù)值為7.17%、5.63%、2.10%，表明在冷藏十四天以內(nèi)該溶液處于穩(wěn)定狀態(tài)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（簡(jiǎn)稱為HPLC-MS）對(duì)血漿中紫杉醇濃度進(jìn)行檢測(cè)，具有檢測(cè)速度快、檢測(cè)靈敏度高的特點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)臨床治療過(guò)程中的檢測(cè)要求[4]。

參考文獻(xiàn)：

[1]李天雪，胡玉濤，陳如洋， 褚朝森.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中阿帕替尼與紫杉醇[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)， 2018， 4（37）： 477～481.

[2]陳華，吳筱丹，許東航，徐翔.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定人血漿紫杉醇濃度[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)， 2007， 7（26）： 734～736.

[3]陳小歡，許杜娟，夏泉，等.反相高效液相色譜法測(cè)定人血漿中紫杉醇的濃度[J].安徽醫(yī)藥， 2012，16（1）：35-37.

[4]劉韜，黃紅兵，林子超，等.高效液相色譜法測(cè)定人血漿中多西紫杉醇濃度[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2007， 27（7）：897-899.