孫夢(mèng)雪，韓 雪，楊玉輝，唐 雪,2，成向榮,2，施用暉,2，樂國(guó)偉,2*

1江南大學(xué)食品學(xué)院；2食品營(yíng)養(yǎng)與功能食品工程技術(shù)研究中心，無錫 214122

隨著現(xiàn)代經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人們的飲食結(jié)構(gòu)和生活方式發(fā)生了巨大變化。高脂、高熱能食物過量攝入，體內(nèi)脂肪不斷的累積，成為肥胖、糖尿病的重要發(fā)病因素。此外，快速的生活節(jié)奏，沉重的工作壓力使機(jī)體長(zhǎng)期處于精神高度緊崩狀態(tài)，導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素(GC)水平上升，機(jī)體血糖和血壓水平增高，加重了患病的風(fēng)險(xiǎn)。

胰島素抵抗(IR)是糖尿病、肥胖和高血壓等慢性代謝疾病的典型特征[1]。地塞米松(DEX)是一種人工合成的糖皮質(zhì)激素，研究表明，大鼠在長(zhǎng)期高脂飲食、急性或慢性DEX暴露的情況下，機(jī)體血脂代謝發(fā)生紊亂，血糖及胰島素水平升高，產(chǎn)生IR和嚴(yán)重的氧化應(yīng)激損傷[2-4]。因此，研究如何緩解IR狀態(tài)下機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)具有重要的意義。

近年來，蟲草發(fā)酵菌絲體(CM)受到研究者的廣泛關(guān)注。其主要化學(xué)成分及生物活性與天然蟲草相似[5,6]，具有降血糖、抗炎和抗氧化等多種功能[7-9]。目前關(guān)于CM體內(nèi)抗氧化研究的報(bào)道較少，因此，本研究采用高脂飲食聯(lián)合腹腔注射DEX誘導(dǎo)IR模型，初步探究CM對(duì)IR大鼠氧化應(yīng)激水平的影響，為CM的應(yīng)用與推廣提供一定的理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPF級(jí)雄性Wistar 大鼠40 只，4～6 周齡，130～150 g，斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，SCXK(滬)2012-0002，地塞米松磷酸鈉注射液(天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司)，蟲草發(fā)酵菌絲體(CM，市售)，血糖試紙(強(qiáng)生穩(wěn)豪)。

1.2 儀器

強(qiáng)生穩(wěn)豪倍優(yōu)血糖儀(強(qiáng)生醫(yī)療器材有限公司)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)5804R(Eppendorf 公司)，-80 ℃超低溫冰箱(Thermo Scientific 公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó) Biotek 公司)，PCR 擴(kuò)增儀ETC811(東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司)，ABI 7900 HT FAST 熒光定量PCR儀(美國(guó)應(yīng)用系統(tǒng)公司)。

1.3 胰島素抵抗大鼠模型及分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按體重隨機(jī)分成5組，正常對(duì)照組(C組)，模型組(IR組)，CM低劑量組(CM1組，劑量為1.65 g/kg 飼料)，CM中劑量組(CM2組，劑量為3.30 g/kg 飼料)，CM高劑量組(CM3組，劑量為6.60 g/kg 飼料)。IR模型采用高脂飲食聯(lián)合腹腔注射DEX誘導(dǎo)(高脂飼料喂養(yǎng)三周后，連續(xù)4 周腹腔注射劑量為0.80 mg/kg體質(zhì)量的 DEX)。CM干預(yù)組分別飼喂添加低、中、高劑量CM的高脂飼料，腹腔注射等量DEX；正常對(duì)照組飼喂正常飼料，腹腔注射等量生理鹽水。飼料配方[10]見表1，大鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，每組2籠，每籠4 只，自由攝食和飲水，每周稱重并記錄，末次飼喂后，隔夜禁食不禁水12 h，心臟取血，分離血漿，取出骨骼肌，肝臟組織，液氮處理后保存于-80 ℃冰箱。

表1 飼料配方(%)Table 1 Composition of experimental diets (%)

1.4 測(cè)定指標(biāo)及實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 CM體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.4.2 口服糖耐量實(shí)驗(yàn)

DEX注射4 周后，隔夜禁食不禁水12 h，尾部采血測(cè)0 min血糖(FBG)，0 min胰島素(FINS)。50% 葡萄糖溶液灌胃后，分別在30，60，120 min測(cè)血糖值，計(jì)算血糖曲線下面積(AUC)，胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，胰島素敏感指數(shù)(HOMA-IS)。

1.4.3 血漿、肌肉、肝臟組織ROS測(cè)定

作為珠海市港航物流領(lǐng)域最具影響力、規(guī)模最大的盛會(huì)—“港航物流發(fā)展珠海論壇”至今已經(jīng)成功舉辦五屆，歷屆論壇聚集頂級(jí)專家和行業(yè)領(lǐng)袖，聚焦珠海港航物流，全方位探討行業(yè)發(fā)展問題，多角度獻(xiàn)策行業(yè)科學(xué)發(fā)展，為珠海區(qū)域物流體系建設(shè)和經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展貢獻(xiàn)了思維之光和破題之策。

心臟取血后，冰浴上取出肌肉和肝臟組織，利用 MP1-B 型多參數(shù)化學(xué)發(fā)光測(cè)試儀測(cè)定全血、肌肉和肝臟 ROS 水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以發(fā)光峰積分值(RLUs) 表示[11]。

1.4.4 血脂的測(cè)定

心臟取血后，4 ℃，3 000 rpm，離心10 min ，取上層血漿，參照試劑盒說明書測(cè)定血漿中TG、TC、LDL、HDL、FFA。

1.4.5 血漿、肌肉、肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定

10% 的肌肉、肝臟組織勻漿液，4 ℃，3 000 rpm，離心10 min ，取上清液，參照試劑盒說明書測(cè)定血漿、肌肉和肝臟組織中丙二醛MDA、T-AOC和GSH-Px。

1.4.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

表2 引物序列Table 2 Sequence of the primers used in Real-Time PCR

1.4.7 Western blot法測(cè)定Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)

RIPA裂解液處理肌肉、肝臟組織提取總蛋白，BCA測(cè)定蛋白濃度，將各組蛋白稀釋成統(tǒng)一濃度后，進(jìn)行電泳、印跡、抗體孵育，ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯色，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描和拍照，分析目標(biāo)條帶的灰度值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 體外實(shí)驗(yàn)對(duì)CM清除自由基作用研究

圖1 CM(a)and VC(b)對(duì)的清除作用 Fig.1 Eliminating effect of CM (a) and VC (b) on

2.2 CM對(duì)IR大鼠體重的影響

由圖2可知，各組大鼠初始體重?zé)o顯著性差異(P>0.05)，高脂喂養(yǎng)3 周后，IR組和CM干預(yù)組大鼠體重顯著高于C組(P<0.01)；腹腔注射DEX 4 周后，與C組相比，IR組大鼠體重顯著下降(P<0.01)；與IR組相比，CM1、CM2和CM3組體重增加(P>0.05)。

圖2 CM對(duì)IR大鼠體重的影響 Fig.2 Effect of CM on body weight in IR rats (n 注：與正常組比較， * P<0.05，** P<0.01；與IR組比較，# P<0.05，## P<0.01Note：Compare with control rats,* P < 0.05,** P < 0.01;Compare with IR rats，# P < 0.05,## P < 0.01

2.3 CM對(duì)IR大鼠血糖、AUC、HOMA-IR、HOMA-IS的影響

由圖3和表3可知，與C組相比，IR組血糖水平、AUC、FINS、HOMA-IR顯著上升(P<0.01)，HOMA-IS 顯著下降(P<0.01)；與IR組相比，CM3組0 min、120 min血糖及AUC顯著下降(P<0.01,P<0.01,P<0.05)，CM1、CM2、CM3組0 min胰島素、HOMA-IR均顯著下降(P<0.01)，HOMA-IS 顯著上升(P<0.01)。

圖3 CM對(duì)IR大鼠血糖水平(a)和葡萄糖曲線下面積(b)的影響Fig.3 Effect of CM on blood glucose (a) and AUC (b) in IR rats(n

表3 CM對(duì)IR大鼠血糖FINS、HOMA-IR和HOMA-IS的影響Table 3 Effect of CM on insulin level,HOMA-IR and HOMA-IS in IR rats (n =

2.4 CM對(duì)IR大鼠血脂的影響

由表4可知，與C組相比，IR組血漿TC、TG、LDL和FFA含量顯著增加(P<0.01)，HDL含量顯著降低(P<0.01)；與IR組相比，CM1、CM2、CM3組血漿TG、LDL、FFA含量顯著降低(P<0.01)，HDL含量顯著增加(P<0.01)。

2.5 CM對(duì)IR大鼠氧化還原狀態(tài)的影響

由表5可知，與C組相比，IR組血漿、肌肉和肝臟組織ROS、MDA含量顯著增加(P<0.01)，T-AOC、GSH-Px酶活性顯著降低(P<0.01)；與IR組相比，CM1、CM2、CM3組血漿、肌肉和肝臟組織ROS、MDA含量顯著降低(P<0.01)，T-AOC、GSH-Px酶活性顯著升高(P<0.01)，其中CM3組的效果最佳。

表4 CM對(duì)IR大鼠血脂的影響Table 4 Effect of CM on lipid levels in IR rats (n

表5 CM對(duì)IR大鼠氧化還原狀態(tài)的影響Table 5 Effect of CM on redox indicator of in IR rats (n

圖4 CM對(duì)胰島素抵抗大鼠肌肉(a)和肝臟(b)氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)水平的影響Fig.4 Effect of CM on the mRNA expression of oxidative stress related in IR rats muscle (a) and liver (b)

2.6 CM對(duì)IR大鼠肌肉和肝臟組織中氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

由圖4可知，與C組相比，IR 組大鼠肌肉和肝臟組織中 Nrf2、HO-1 、NQO1 mRNA的表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.01)；與IR組相比，CM干預(yù)后IR大鼠肌肉和肝臟組織中Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)，其中CM3組的效果最佳。

2.7 CM對(duì)IR大鼠肌肉和肝臟組織中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)水平的影響

由圖5可知，與C組相比，IR組大鼠肌肉、肝臟組織中Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下降(P<0.05)；與IR組相比，CM3組IR大鼠肝臟組織Nrf2、NQO1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，肌肉組織中CM3組NQO1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著上升(P<0.05)。

圖5 CM對(duì)IR大鼠肌肉(a)和肝臟(b)組織中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)水平的影響Fig.5 Effect of CM on the expression of Nrf2、HO-1、NQO1 protein in IR rats muscle (a) and liver (b)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用高脂飲食聯(lián)合腹腔注射DEX來誘導(dǎo)大鼠IR模型，口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IR組大鼠空腹血糖、空腹胰島素、血糖曲線下面積以及胰島素抵抗指數(shù)顯著高于正常大鼠，胰島素敏感指數(shù)顯著下降，說明成功誘導(dǎo)了大鼠IR模型。

氧化應(yīng)激在IR發(fā)生過程中扮演了重要角色[12,13]。本研究體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CM能夠有效清除-OH、DPPH和超氧陰離子自由基，說明CM具有良好的體外抗氧化活性。有研究表明，長(zhǎng)期高脂飲食，大鼠血漿TG、TC和FFA含量顯著增加，糖脂代謝紊亂，機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性下降[14]。機(jī)體在肥胖、高血糖、高血脂狀態(tài)下，通過提高ROS的含量，降低機(jī)體抗氧化能力，產(chǎn)生氧化應(yīng)激[15]。本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CM干預(yù)能夠顯著降低高脂飲食IR大鼠血脂及血糖水平，其中CM3組的效果最佳；此外，CM干預(yù)后IR大鼠體內(nèi)ROS及MDA含量顯著降低，抗氧化酶T-AOC和GSH-Px(機(jī)體抗氧化系統(tǒng)中重要的酶)的活性顯著提高；說明了CM具有顯著改善IR大鼠血脂、血糖以及機(jī)體氧化應(yīng)激的作用。Nrf2通路是迄今為止發(fā)現(xiàn)最為重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，其可上調(diào)抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶HO-1和NQO1的表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力[16]。研究表明，機(jī)體產(chǎn)生IR時(shí)，Nrf2表達(dá)量下調(diào)[17]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CM干預(yù)后， 肌肉和肝臟組織中Nrf2、HO-1和NQO1 mRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)；肝臟組織Nrf2、NQO1蛋白的表達(dá)量也顯著上調(diào)；表明CM可能是通過上調(diào)IR大鼠機(jī)體Nrf2基因和蛋白的表達(dá)，使其下游抗氧化基因表達(dá)增加，從而降低機(jī)體的氧化應(yīng)激水平。

綜上所訴，CM可能是通過激活Nrf2途徑緩解機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而改善IR大鼠血糖、血脂水平，提高機(jī)體胰島素的敏感性。