楊佳麗，趙陽，杜麗，盧育新，程曉晨，潘自強，趙希榮* ，張慶林*

(1．淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇淮安223003;2．軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京100850)

馬齒莧(PortulacaoleraceaL．)為馬齒莧科馬齒莧屬植物，一年生肉質(zhì)草本生物，民間稱其為長壽菜、螞蟻菜、瓜子菜等。馬齒莧鮮品含有生物堿、黃酮、多糖、多不飽和脂肪酸等成分，不僅具有很高的營養(yǎng)價值，而且具有提高人體免疫力、降血糖、降血脂、抗菌、治療濕疹、丹毒、熱毒血痢、癰腫療瘡等作用功效［1］。馬齒莧被稱為天然抗生素，據(jù)文獻報道馬齒莧黃酮對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有較強的抑制作用。濕疹是常見的變態(tài)反應(yīng)性炎癥性皮膚病，病因復(fù)雜多樣，其外部的細菌(如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等)及真菌感染會加重病情。由于濕疹病情反復(fù)，難以根治，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。在臨床治療中發(fā)現(xiàn)馬齒莧對濕疹療效顯著，目前治療濕疹采用的馬齒莧多為干品，少有關(guān)于馬齒莧鮮品對濕疹治療的研究。馬齒莧治療急性濕疹通常采用外洗方，存在滲透性差、不易清洗等問題。在研究過程中發(fā)現(xiàn)馬齒莧鮮汁提取物凍干品吸濕性較強，不易保存，限制了其使用。凝膠劑是一種常見的半固體制劑，由于本身的液體成分較多，可以克服鮮汁提取物吸濕性，具有黏附性好、滲透性強、易于清洗、患者易接受等優(yōu)點，是常用的劑型之一。本研究將馬齒莧鮮汁凍干品制成凝膠劑型，以卡波姆-940為主要載體，綜合凝膠劑的感官指標(biāo)和實驗指標(biāo)評分對馬齒莧鮮品凝膠劑制備工藝進行多因素考察，并采用正交試驗篩選出最佳處方。對馬齒莧鮮品凝膠進行抑菌實驗，觀察凝膠對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑制作用。通過動物實驗，觀察馬齒莧鮮品凝膠對 2，4-二硝基氯苯(2，4-dinitro-chlorobenzene，DNCB)所致小鼠急性濕疹模型的治療作用，旨在開發(fā)馬齒莧治療濕疹的新劑型。

1 材料與方法

1．1 儀器 臺式高速離心機(湖南湘儀，型號：H-1850R);pH計(MettlerToledo);光學(xué)顯微鏡(OlympusCX4lRF);-20℃低溫冰箱(海爾冰箱);超凈工作臺(北京昌平儀器公司);隔水型恒溫培養(yǎng)箱(天津泰勒斯特儀器公司);高壓蒸汽滅菌鍋(上海申安儀器公司)。

1．2 實驗材料 卡波姆-940(上海麥克林生化科技有限公司);氧氟沙星膠囊(江西黃河藥業(yè));Tween-80(GFCOChemicalSupplies);復(fù)方黃柏液(江西蓋天靈藥業(yè));羥苯乙酯、1，2-丙二醇、氮酮及 2，4-二硝基氯苯(DNCB)均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。金色葡萄球菌(ATCC25922)、大腸桿菌(ATCC29213)由本實驗室保存。

1．3 實驗動物 健康昆明小鼠40只，雌雄各半，體重(22±4)g，由軍事醫(yī)學(xué)研究院動物實驗中心提供［合格證號：SCXK(軍)2012-0004］，飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)研究院動物實驗中心。實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度保持在24℃左右，晝夜明暗交替時間為12h/12h，相對濕度保持在40%～70%;標(biāo)準(zhǔn)飼料和水供動物自由飲食。

1．4 馬齒莧鮮品凝膠的制備 將采購自江蘇的鮮馬齒莧榨汁，榨汁液濃縮凍干。將馬齒莧凍干品0．1 g、羥苯乙酯(少量無水乙醇溶解)0．1g、1，2-丙二醇5mL、Tween-800．1g 及氮酮 0．1g 置于研缽中研磨，研磨充分后加入凝膠基質(zhì)攪拌［3］。用適量10%NaOH溶液調(diào)pH至6．5，總質(zhì)量最終為50g。

1．5 馬齒莧鮮品凝膠的優(yōu)化

1．5．1 卡波姆的用量 按照“1．3”項下操作，設(shè)置不同濃度的卡波姆(0．4%、0．5%、0．6%、0．7%、0．8%)，其他因素不變，平行制備5份凝膠劑，按照表1評分標(biāo)準(zhǔn)進行考察。

1．5．2 丙二醇的用量 按照“1．3”項下操作，設(shè)置不同濃度的丙二醇(5%、10%、15%、20%、25%)，其他因素不變，平行制備5份凝膠劑，按照表1評分標(biāo)準(zhǔn)進行考察［4］。

表1 卡波姆凝膠劑基質(zhì)考察評分標(biāo)準(zhǔn)

1．5．3 pH 優(yōu)化 按照“1．3”項下操作，以 10%NaOH 為調(diào)節(jié)劑，設(shè)置不同的 pH 值(4．5、5．5、6．5、7．5、8．5、9．5)，平行制備 5 份凝膠劑，按照表 1 評分標(biāo)準(zhǔn)進行考察。

1．6 凝膠劑質(zhì)量檢測 對于凝膠制劑處方評價的方式較為廣泛，如果采用單一的感官評價指標(biāo)對凝膠劑的處方進行評價會顯得結(jié)果不夠準(zhǔn)確［5］。本實驗在相關(guān)文獻基礎(chǔ)上，除了采用感官指標(biāo)評價外，以理化指標(biāo)(耐寒穩(wěn)定性、耐熱穩(wěn)定性及抗菌性)對凝膠質(zhì)量進行評價。

1．6．1 離心試驗 取3批凝膠劑各5g置于離心管中，6000rpm離心15min取出，觀察凝膠有無分層及顏色變化。

1．6．2 耐寒試驗 取3批凝膠劑各5g置于-20℃冰箱中48h取出，觀察凝膠有無分層及顏色變化。

1．6．3 耐熱試驗 取3批凝膠劑各5g置于55℃水浴中2h取出，觀察凝膠有無分層及顏色的變化［6］。

1．6．4 凝膠劑抗菌活性 在無菌操作臺中，將金色葡萄球菌和大腸桿菌搖床培養(yǎng)過夜，計數(shù)并稀釋至106個/mL。吸取100μL稀釋后的菌液均勻涂布在固體LB培養(yǎng)基上，晾干后用無菌的打孔器打孔(直徑為7mm)。向孔內(nèi)分別加30μL的生理鹽水作為陰性對照、陽性藥(氧氟沙星凝膠)，空白原位凝膠、馬齒莧鮮品凝膠及凍干馬齒莧(溶于生理鹽水)各0．5g，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h觀察抑菌圈。

1．7 小鼠濕疹模型 將小鼠隨機分為凝膠組、復(fù)方黃柏液組(HB組)、陰性對照組及正常組共4組，每組10只。在每只小鼠頸背部剪毛(面積2cm×2 cm)，除正常組外，其他3組小鼠去毛后當(dāng)日及次日于去毛部涂5%DNCB(100μL/只)各一次致敏，第7天涂1%DNCB(100 μL/只)激發(fā)［7］。激發(fā) 24h后給藥，復(fù)方黃柏液組涂抹復(fù)方黃柏液(500 μL·cm-2)，陰性對照組涂抹等量生理鹽水，凝膠組涂抹0．5g馬齒莧鮮品凝膠，每天2次，連用7d。

1．8 皮膚組織病理檢查 給藥7d后，頸椎脫臼法處死小鼠，取小鼠濕疹模型部位皮膚組織，10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色。光學(xué)顯微鏡觀察皮膚組織病理改變［9］。

2 實驗結(jié)果

2．1 馬齒莧鮮品凝膠的優(yōu)化

2．1．1 卡波姆的用量 卡波姆的濃度為 0．4%、0．5%、0．6%、0．7%、0．8%時，凝膠劑的評分分別為7．7、7．9、8．0、8．7、8．5，即卡波姆濃度為 0．7%最佳，結(jié)果見表2。

表2 不同濃度卡波姆凝膠基質(zhì)的綜合評分

2．1．2 丙二醇的用量 丙二醇的濃度為5%、10%、15%、20%、25%時，凝膠劑的評分分別為 8．0、8．6、8．4、9．0、8．3，據(jù)此選擇丙二醇的濃度 20%，結(jié)果見表 3。

表3 不同濃度丙二醇凝膠基質(zhì)的綜合評分

2．1．3 pH pH 為 4．5、5．5、6．5、7．5、8．5、9．5 時，凝膠劑的評分分別為 5．8、8．4、9．0、8．4、7．9、4．6，pH 值為6．5時凝膠劑評分最高，結(jié)果見表4。

2．2 正交試驗 根據(jù)以上單因素試驗結(jié)果，選擇卡波姆-940濃度(A)、丙二醇濃度(B)和pH值(C)作為考察影響凝膠劑的主要因素，每個因素設(shè)3個水平，按L9(34)正交表進行試驗，因素水平見表5，正交試驗結(jié)果見表6。

試驗結(jié)果如表6所示，RA=RC＞RB各因素對試驗指標(biāo)影響的主次順序是A=C＞B，即對凝膠劑影響較大的是卡波姆-940用量和pH。另外，正常皮膚是弱酸性的，表面pH一般維持在4．5～6．5。綜合以上因素，最終采用的制備工藝為A2B1C2，即卡波姆-9400．7%，丙二醇 10%，pH6．5。

表4 不同pH凝膠基質(zhì)的綜合評分

表5 因素水平表

表6 正交設(shè)計表

2．3 驗證試驗 用正交試驗優(yōu)選的工藝條件卡波姆-9400．7%，丙二醇 10%，pH6．5 平行制備 3 批凝膠劑，綜合評分分別為 9．3、9．4、9．0。結(jié)果表明該制備工藝穩(wěn)定，后續(xù)實驗均采用此處方。

2．4 抑菌實驗 對金色葡萄球菌的抑菌實驗結(jié)果顯示(見圖1A)，馬齒莧鮮品凝膠、馬齒莧干品提取物和陽性對照均有抑菌圈出現(xiàn)，馬齒莧鮮品凝膠的抑菌圈明顯大于馬齒莧干品提取物，陰性對照和空白原位凝膠無抑菌圈;對大腸桿菌的抑菌實驗顯示(見圖1B)，馬齒莧鮮品凝膠和陽性對照孔有抑菌圈，而凍干馬齒莧、陰性對照和空白原位凝膠無抑菌圈出現(xiàn)。實驗結(jié)果表明，馬齒莧鮮品凝膠保留了馬齒莧的抑菌活性，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有抑制作用，而凝膠的抑菌作用可以幫助減緩濕疹的癥狀。

圖1 對金色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌實驗結(jié)果

2．5 對小鼠急性濕疹治療研究 小鼠急性濕疹模型建立結(jié)果顯示，DNCB激發(fā)后陰性對照組皮膚出現(xiàn)紅腫、糜爛面、有明顯漿液性滲出，表明造模成功;HB組及馬齒莧鮮品凝膠組背部紅腫、糜爛等現(xiàn)象減輕，表明馬齒莧鮮品凝膠可以緩解急性濕疹的癥狀(見圖2)。光學(xué)顯微鏡觀察皮膚病理切片顯示(見圖3)，陰性對照組表皮增厚，顆粒層輕度肥厚，棘層細胞內(nèi)水腫，真皮內(nèi)炎細胞(淋巴細胞)浸潤明顯，符合急性濕疹病理改變。HB組棘層細胞內(nèi)輕度水腫，真皮內(nèi)有少量炎細胞浸潤，較陰性對照組癥狀明顯減輕。馬齒莧鮮品凝膠組顆粒層肥厚癥狀改善、棘層細胞內(nèi)水腫明顯改善，真皮內(nèi)炎細胞數(shù)量明顯減少。實驗結(jié)果顯示，馬齒莧鮮品凝膠可以有效抑制DNCB所誘發(fā)的小鼠急性濕疹反應(yīng)，明顯減輕急性濕疹小鼠皮膚組織的炎癥反應(yīng)，表明馬齒莧鮮品凝膠對急性濕疹有明確療效。

圖2 小鼠濕疹模型

3 討論

圖3 小鼠濕疹皮膚病理切片(HE，100×)

凝膠制劑系指藥物與能形成凝膠的輔料制成均一、混懸或乳狀液型的稠厚液體或半固體制劑。本研究首次將鮮品馬齒莧用于凝膠制備，解決了鮮品馬齒莧凍干品吸濕性強的問題。在凝膠劑制備中卡波姆-940用量會影響凝膠黏度和藥物釋放，pH值對外觀形狀有重要影響，丙二醇可作為凝膠劑的助溶劑和保濕劑，因此實驗中考察了不同卡波姆-940濃度、pH值及丙二醇濃度對凝膠劑質(zhì)量的影響。通過正交試驗，確定凝膠劑的最優(yōu)配方即0．7%卡波姆，10%丙二醇，pH6．5。對優(yōu)化的馬齒莧鮮品凝膠進行了質(zhì)量檢測，結(jié)果顯示制備的馬齒莧鮮品凝膠劑經(jīng)離心、耐寒及耐熱實驗，穩(wěn)定性良好，無分層及顏色變化。抑菌實驗結(jié)果顯示，凝膠劑型保留了馬齒莧的抑菌活性，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌有明顯抑制作用，而凝膠劑的抑菌作用可以緩解濕疹的癥狀。

中醫(yī)認為濕疹多是由于風(fēng)、濕、熱邪郁于局部，與氣血相互搏結(jié)形成，故選用清熱解毒，散血消腫等藥物治療。在濕疹的發(fā)病中以急性濕疹最為常見，發(fā)病時皮膚出現(xiàn)紅斑、丘疹、水泡、糜爛、滲出，往往伴有劇烈的瘙癢［11］。有文獻報道馬齒莧可用于治療急性濕疹［10］，因此為了研究馬齒莧鮮品凝膠劑對濕疹的治療作用，采用DNCB反復(fù)激發(fā)建立了小鼠濕疹模型。馬齒莧鮮品凝膠涂抹給藥后，皮膚病理結(jié)果顯示，馬齒莧鮮品凝膠治療后濕疹皮膚的炎癥反應(yīng)明顯減輕，表明馬齒莧鮮品凝膠對小鼠濕疹具有治療作用。

綜上所述，本研究通過優(yōu)化成功制備了馬齒莧鮮品凝膠，抗菌實驗表明馬齒莧鮮品凝膠保留了馬齒莧的抑菌活性，進一步的動物實驗也表明其對小鼠濕疹具有明顯的治療作用，為馬齒莧治療濕疹研究提供研究基礎(chǔ)。然而，對馬齒莧鮮品凝膠劑的劑型研究，如體外釋藥、離體皮膚透皮等以及馬齒莧鮮品的有效成分等均有待于進一步研究。