王美霞　惠金聚　陳宸　郭秀娜　李多川

摘要：多糖單加氧酶（polysaccharide monooxygenases，PMOs）可以氧化裂解纖維素，為纖維素酶提供更多的結(jié)合位點，對提高纖維素酶的活性具有重要意義。本研究旨在探索嗜熱毛殼菌（Chaetomium thermophilum）AA9家族PM05456的氧化方式，以及與不同類型纖維素酶的協(xié)同作用。通過對PMO反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，確定PM05456具有CI、C4、C6位氧化。設(shè)置時間梯度，以PM05456預(yù)處理的磷酸膨脹纖維素（PASC）為底物，測定PM05456與嗜熱毛殼菌三種纖維素酶EGl、CT2、CBHI的協(xié)同作用，結(jié)果顯示隨著PM05456預(yù)處理纖維素時間的增加，纖維素酶的活性隨之增加。PM05456對三種纖維素酶EGI、CBHl、CT2的降解效率分別提高了3.6、2.2倍和60%。

關(guān)鍵詞：嗜熱毛殼菌;AA9家族;多糖單加氧酶;氧化方式;協(xié)同作用

Study on Properties and Synergistic Effects ofPolysaccharide Monopolygenase from Chaetomium thermophilumWang Meixia， Hui Jinju， Chen Chen， Guo Xiuna， Li Duochuan

Abstract

Polysaccharide monooxygenases （ PMOs） can oxidize cellulose to provide more binding sitesfor cellulase， which is important for improving cellulase activity. This study aimed to explore the oxidativemode of PM05456 0f the AA9 family from Chaetomium thermophilum and its synergistic effect with differenttypes of cellulases. By identifying the PMO reaction products， it was determined that PM05456 had oxidationat the Cl， C4 and C6 positions. The time gradient was set， and the synergistic effects of PM05456 and threecellulases， EGl， CT2 and CBHl， from Chaetomium thermophilum were determined by using PM05456 pre-treated with phosphoric acid - swollen cellulose （PASC） as the substrate. The results showed that with the in-crease of pretreatment time of PM05456， the cellulase activity increased. The degradation efficiencies ofPM05456 for the three cellulases， EGl ， CBHl ， and CT2 ， increased by 3. 6， 2. 2 times and 60% ， respectively.

Keywords Chaetomium thermophilum; AA9 family; Polysaccharide monooxygenase; Oxidation mode;Synergy

纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分，是地球上豐富的可再生能源[1]，而木質(zhì)纖維素生物質(zhì)因其B-i，4糖苷鍵連接的線性多糖結(jié)構(gòu)而難以被降解，這一特性是以纖維素作為二代生物燃料的生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)面臨的主要問題之一。能夠降解纖維素的酶廣泛存在于細(xì)菌和真菌中[2-4]，然而自然狀態(tài)下的結(jié)晶纖維素需要經(jīng)過工業(yè)、物理或化學(xué)預(yù)處理才能被纖維素酶降解[5]，處理后產(chǎn)生的多種結(jié)晶纖維素極易與細(xì)胞壁的其他成分相互作用，從而限制了酶與底物的結(jié)合，導(dǎo)致酶的降解效率低[6]因此，合理高效的預(yù)處理以增加糖苷水解酶與底物的結(jié)合是降解纖維素亟待解決的問題。

多糖單加氧酶是一種銅離子依賴酶[7]，通過氧化斷裂纖維素的糖苷鍵使纖維素結(jié)構(gòu)更加松散，暴露出更利于纖維素酶結(jié)合的位點，利于纖維素酶與底物的結(jié)合，提高纖維素酶的活性[8-9]。在降解酶系中，一般認(rèn)為有三類纖維素酶：內(nèi)切纖維素酶（內(nèi)切-1，4-B-葡聚糖酶，EGs，E.C.3.2.1.4），外切纖維素酶（纖維二糖水解酶，cello-biohydrolases，CBHs，E.C.3.2.1.91;糖水解酶，E.C.3.2.1. 74），B-葡萄糖苷酶（BGs，E.C.3.2.1.21）[10]。三種纖維素酶與PMO協(xié)同作用促進(jìn)纖維素降解的進(jìn)程。

PMO是一類氧化酶，能夠氧化葡萄糖苷的C1、C4位和C6位[ll]，但是具體家族成員的氧化區(qū)域的選擇性差異仍有待探究。其中真菌中的多糖單加氧酶AA9（ auxiliarv activity 9，AA9）家族受到較多關(guān)注[12-13]，作用于纖維素的AA9家族是一類胞外酶，可以異源表達(dá)。來自嗜熱真菌的酶比常溫真菌的酶具有更高活性并且具有熱穩(wěn)定性，這一特性將更有利于在工業(yè)生產(chǎn)的應(yīng)用。因此，本研究以嗜熱毛殼菌為研究對象，以期為嗜熱毛殼菌AA9家族多糖單加氧酶的生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1. 1.1 菌株與載體 嗜熱毛殼菌（Chaetomiumthermophilum）CGMCC3. 17990菌株由本實驗室保存;大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)細(xì)胞T1購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115、pPICZαA表達(dá)載體購自Invitrogen（美國）公司。

1.1.2PM05456與三種水解酶信息 多糖單加氧酶PM05456與三種纖維素水解酶EG1、CT2 [14]、CBHl [15]相關(guān)信息見表1。

1.1.3試驗試劑試驗所用試劑見表2。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因克隆 以微晶纖維素誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)嗜熱毛殼菌3—5d，采用RNA提取試劑盒提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板、PM05456 - cF和PM05456 - cR為引物（表3）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：cDNA 2μL，上下游弓I物各2 μL，5×TransStart⑥FastPfu Buffer 10 μL，dNIPs（2.5 mmol/L）5VL，TransStart⑥FastPfu DNAPolymerase lμL，ddH20 28μL。PCR反應(yīng)程序：950C 1 min;950C 20 s，55C 20 s，720C 40 s，共35個循環(huán);72℃ 5 min，4℃保存。引物設(shè)計首先去除PM05456序列的信號肽，然后參照pPICZaA質(zhì)粒酶切位點和序列進(jìn)行設(shè)計，其中引入Xho I和XbaI兩個酶切位點，并添加一個胞嘧啶核苷酸（下劃虛線）以保證下游組氨酸標(biāo)簽順利表達(dá)。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定及轉(zhuǎn)化經(jīng)膠回收的PM05456基因片段與經(jīng)Xho I和Xba I酶切的pPICZαA質(zhì)粒連接，構(gòu)成重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入T1感受態(tài)中，轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞涂布在含博來霉素（Zeocin）的低鹽LB平板上。經(jīng)37C培養(yǎng)24 h后挑取生長狀態(tài)良好的單菌落若干，以5-AOXI（ 5- GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'）和3- AOXl（5-GGCAAATGGCATTCTGA-CAT -3'）作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序選取正確的轉(zhuǎn)化子。PCR反應(yīng)體系為：懸浮菌液3μL，上下游引物各1.5μL，2×Taq PCR MasterMix 25μL，ddH20 19μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃ 2 min;94℃ 30 s，55C 30 s，72℃30 s，共30個循環(huán);72℃ 10 min，4qC保存。

1.2.3 工程菌的構(gòu)建培養(yǎng)并提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)Sac I線性化后回收，經(jīng)電擊轉(zhuǎn)入畢赤酵母感受態(tài)GS115中，涂布于含Zeocin的平板上，28℃培養(yǎng)3d，挑取生長良好的單菌落若干，試劑盒提取酵母基因組，以5- AOX1和3-AOX1作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體方法同1.2.2，測序選擇正確的酵母轉(zhuǎn)化子作為工程菌用于表達(dá)蛋白。

1.2.4 PM05456的表達(dá)、分離與純化 挑取培養(yǎng)的工程菌菌落，無菌環(huán)境下接種于BMGY培養(yǎng)基中，24 h后菌體轉(zhuǎn)入BMMY培養(yǎng)基，每12 h添加甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，每100 mL BMMY加入1 mL甲醇，于28qC、200 r/min培養(yǎng)7d。經(jīng)硫酸銨沉淀分離蛋白，采用鎳柱親和純化獲得PM05456蛋白。

1.2.5 PM05456可溶性酶解產(chǎn)物分析

（1）可溶性產(chǎn)物薄層色譜（TLC）分析：以1%磷酸膨脹纖維素（ PASC）為底物，1 mL PASC中加入1 mL PM05456酶液，加入Vc至終濃度1mmol/L作為還原劑，在pH =5.0環(huán)境下50C水浴振蕩反應(yīng)48 h。離心取10 μL上清進(jìn)行TLC分析，以標(biāo)準(zhǔn)纖維寡糖為參照初步分析產(chǎn)物成分。

（2）可溶性產(chǎn)物MALDI - TOF - MS鑒定：將上述48 h酶解產(chǎn)物離心，取上清20 μL，于北京軟隆生物技術(shù)有限公司進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（ MALDI-TOF-MS）分析。

（3）產(chǎn)物溴水氧化：每一體積酶解產(chǎn)物上清液中加入三體積飽和溴水，于60C水浴反應(yīng)30min，經(jīng)氮吹儀吹干后回溶至產(chǎn)物原體積，進(jìn)行MALDI-OF-MS鑒定。

1.2.6 協(xié)同作用 采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定糖苷水解酶活力：1%的PASC加入等體積已純化的多糖單加氧酶，500C水浴振蕩反應(yīng)，反應(yīng)時間梯度設(shè)置為0、12、24、36、48、72、96 h，分別加入內(nèi)切纖維素酶、外切纖維素酶和B -葡萄糖苷酶，對照組加入等體積PBS，50C反應(yīng)20 min后沸水浴10 min終止反應(yīng)。離心取上清加入等體積DNS，沸水煮10 min后測定OD540值，按照測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 PM05456基因克隆

PCR擴(kuò)增目的基因如圖1。測序結(jié)果與已知序列比對，相似性為99.69%。其中兩個堿基發(fā)生同義突變，氨基酸序列未發(fā)生變化。將PCR擴(kuò)增的PM05456基因片段連接pPICZαA質(zhì)粒，構(gòu)成重組質(zhì)粒pPICZαA - PM05456。

2.2 酵母陽性轉(zhuǎn)化子的篩選驗證

對酵母陽性轉(zhuǎn)化子基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖2），經(jīng)測序比對，目的片段已成功轉(zhuǎn)入酵母基因組，轉(zhuǎn)化的酵母陽性轉(zhuǎn)化子可用于表達(dá)目的蛋白。

2.3 表達(dá)純化及SDS - PAGE分析

PM05456表達(dá)純化后的蛋白經(jīng)SDS - PAGE分析（圖3），蛋白大小約28 kD，比PM05456序列分析的理論分子量（25 kD）略大，可能由于存在糖基化修飾。蛋白條帶單一清晰，純度較好，可用于后續(xù)試驗。

2.4 產(chǎn)物分析

2.4.1 產(chǎn)物薄層色譜分析經(jīng)純化的PM05456降解PASC 48 h后離心取上清，TLC結(jié)果（圖4）顯示，PM05456對PASC具有降解活性。

2.4.2 可溶性產(chǎn)物MALDI-TOF-MS分析 為確定PM05456降解PASC的具體產(chǎn)物組成，對可溶性產(chǎn)物進(jìn)行MALDI-TOF- MS分析。結(jié)果（圖5）顯示，PM05456降解PASC可溶性產(chǎn)物中含有多種非氧化型寡糖和氧化型寡糖，證明PM05456具有氧化活性，氧化方式是C1（m/z+16）、C4（m/z-2）或C6（m/z-2）.

2.4.3 可溶性產(chǎn)物溴水氧化后飛行質(zhì)譜分析基于MALDI - TOF - MS分析顯示PM05456氧化方式是C1、C4或C6，為最終確定是C4還是C6氧化，將產(chǎn)物進(jìn)行溴水氧化后進(jìn)一步MALDI - 圖5 PM05456酶解產(chǎn)物的MALDI-TOF-MS分析TOF-MS分析。對產(chǎn)物的作用方式最終為：對CI氧化寡糖（m/z+16）不再繼續(xù)氧化，分子量不會發(fā)生改變;對C4氧化寡糖（m/z-2），溴水將其氧化為C1/C4寡糖，分子量增加14;對C4/C6氧化寡糖，經(jīng)溴水氧化生成C1/C4/C6氧化寡糖，分子量增加28;對C6氧化寡糖（m/z-2），溴水將其氧化為C1/C6氧化寡糖，分子量增加30。溴水氧化后的MALDI-TOF- MS圖（圖6）顯示，PM05456同時存在C1、C4和C6氧化。

2.5 協(xié)同作用分析

協(xié)同作用分析結(jié)果（圖7）顯示，PM05456對三種水解酶的活性提高存在明顯差異，并且隨著PM05456處理纖維素時間的增加，酶活提高的倍數(shù)也隨之增加。在0～48b是迅速提高階段，48h后趨于平緩。PM05456對內(nèi)切纖維素酶的活性提高最明顯，最終提高了3.6倍;外切纖維素酶次之，最終提高了2.2倍;而β-葡萄糖苷酶的酶活提高幅度較低，處理至96h，最終酶活提高了60%。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果顯示PM05456具有C1、C4、C6氧化位點，但三種氧化產(chǎn)物含量存在一定差異，C6氧化產(chǎn)物明顯少于另外兩種。已確定具有C6氧化的酶都需要較長時間產(chǎn)生C6產(chǎn)物，由此推測這種區(qū)域的選擇性相互之間可能存在先后聯(lián)系，因氧化發(fā)生的先后順序而導(dǎo)致產(chǎn)物量的差異。本研究采用飽和溴水氧化產(chǎn)物的方法利用了溴水自身的特性，巧妙避免了帶人其他金屬離子和雜質(zhì)，利用溴水的氧化性將產(chǎn)物氧化分析，后又利用溴水的易揮發(fā)性將殘留的溴完全除去，極大地排除干擾，產(chǎn)物可以直接進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析。

PMO通過在纖維素C1或C4位置加氧引起羥基化作用，造成糖苷鍵斷裂來降解纖維素，這種不同于一般纖維素酶的斷鍵機(jī)制，可能更容易從高度結(jié)晶的纖維素上分離出葡聚糖鏈，并且為纖維素酶提供結(jié)合位點，從而達(dá)到提高纖維素酶解效率的目的。在應(yīng)用中，降解纖維素是由混合酶系完成，一般認(rèn)為由三種纖維素酶共同完成，第一步由內(nèi)切-1，4-β-葡聚糖酶降解產(chǎn)生新的還原端和非還原端，為第二步外切-1，4 -β-葡聚糖酶提供更多的作用位點，最后由β -葡萄糖苷酶水解纖維二糖、海藻糖或龍膽二糖從而釋放出葡萄糖[16-18]一三種纖維素水解酶與PM05456協(xié)同作用的結(jié)果顯示內(nèi)切纖維素酶的酶活提高最高，外切纖維素酶次之，β-葡萄糖苷酶活性影響最小，與混合酶系的反應(yīng)順序?qū)?yīng)，由此可推測PM05456作用底物后主要提高了內(nèi)切纖維素酶的結(jié)合位點，利于纖維素水解酶的結(jié)合，加速了對底物的降解。在工業(yè)應(yīng)用中可利用PMO進(jìn)行纖維素的預(yù)處理，對提高纖維素內(nèi)切酶和外切酶的水解活性具有顯著效果。

參考文獻(xiàn)：[1]Ragauskas A J，Williams C K，Davison B H，et al.The pathfonvard for hiofuels and hiomaterials[J].Science. 2006， 311（5760）：484 -489.

[2]Dimarogona M，Topakas E，Christakopoulos P. Recalcitrantpolysaccharide degradation hv novel oxidative bioc：atalysts[J].Applied Microbiology&Biotechnology， 2013. 97（19）：8455-8465.

[3]Hom S J，Vaaje - Kolstad G，Westereng B，et al.Novel en一zvmes for the degradation of cellulose[J]. Biotechnology forBiofuels. 2012，5（1）：45.

[4] Schwarz W.The t：ellulosome and cellulose degradation lly an-aerobic bacteria[J].Applied Microbiology&Biotechnology，2001，56（ 5/6）：634-649.

[5]MussattoS I，Dragone G，Guimaraes P M R，et al.Technolog-ical trends， glohal market. and challenges of hio - ethanol pro-duction[J].Biotechnology Advances， 2010. 28（6）：817-830.

[6]Himmel M E，Ding S Y，Johnson D K，et al.Biomass recalci-trance： engineering plants and enzVmes for biofuels production[J]. Science， 2007， 315 （5813）：804 - 807.

[7]Beeson W T，Phillips C M，Cate J H，et al.Oxidative cleav-age of cellulose by fungal copper - dependent polysaccharidemonooxygenases[J]. Joumal of the American Chemical Socie-ty， 2012， 134（2）： 890-892.

[8]Aachmann F L，SOrlie M，Skjak-BrEek G，et al.NMR struc-ture of a lytic polysaccharide monooxygenase provides insightinto copper binding， protein dynamics， and suhstrate interac-tions [J] . Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America. 2012， 109 （46） ： 18779 -18784.

[9]Quinlan R J. S，N'eeney M D. Lo L L. et al. Insights imo theoxidative degradation of cellulose by a copper metalloenzymethat exploits biomass components[Jl. Proc. Natl. Acad. Sci.USA， 2011， 108 （37） ： 15079 - 15084.

[10] Zhang Y H P， Hirumel M E. Mielenz J R. Outlook for cellu-lase iruprovement： screening and selection strategies [J] . Bio-technology Advances . 2006 . 24 （5） ： 452 - 481.

[11] Chen C. Chen J， Ceng Z， et al. Regioselectivity of oxidationby a polysacc：haride monooxygenase from Chnetomium t.hfir-i7zophilUm [J] .Biotechnology for Biofuels. 2018. 11 （l） ：155.

[12] Patel I， Kracher D， Ma S， et al. Salt - responsive ly fic poly-saccharide monooxygenases from the mangrove fungus Pestalot.i-op.sis sp. NCi6 [J] . Biotechnology for Biofuels， 2016 ， 9（1） ：108.

[13] Vu V V. Beeson W T，Phillips C M， et al. Determinants of re-gioselective hydroxvlation in the fungal polysaccharide monoox-ygenases[Jl. Journal of the American Chemical Society，2014. 136（2）：562-565.

[14] Xu R， Teng F，Zhang C， et al. Cloning of a gene encodingp - glucosidase from Chaetomium thermophilum. CT2 and its ex-pression in Pichia pa.stori，[J].Joumal of Molecular Mit：robiol-ogy&Biotechnology， 2011， 20（1）：16-23.

[15]楊志芹.嗜熱真菌糖苷水解酶第七家族基因的克隆、表達(dá)及分子改造[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018.

[16] Cota J，Correa T L，Damclsio A R. et al. Comparative analysisof three hyperthermophilic GHI and GH3 family members .vithindustrial potential[J].New Biotechnology， 2015， 32（1）：13-20.

[17] Kostylev M，Wilson D.Synergistic interactions in cellulose hv-drolysis[J].Biofuels， 2012，3（1）：61-70.

[18] Kinsella J E.Principles of enzvmology for the food sciences[J]. Journal of Dairy Science， 1973， 56（8）：1110.