国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

?

微齒菝葜CDDP - PCR體系優(yōu)化、引物篩選及多態(tài)性分析

2019-08-03 07:16張晴臧德奎
山東農業(yè)科學 2019年3期
關鍵詞:體系優(yōu)化

張晴 臧德奎

摘要:利用正交試驗對微齒菝葜CDDP - PCR反應體系的模板DNA和引物濃度進行優(yōu)化。最優(yōu)CDDP -PCR反應體系為:2×Es Taq MasterMix酶(含染料)10μL,0.4μmol/L引物,40 ng DNA模板,ddH7 0補齊至20μL。利用該優(yōu)化體系從21條通用引物中共篩選出12條條帶清晰、多態(tài)性好的引物。利用篩選好的引物對105個微齒菝葜樣品進行擴增,共得到229個位點,其中多態(tài)性位點225個,占總位點數(shù)的98.25%。本試驗表明CDDP分子標記對于微齒菝葜的遺傳多樣性分析、分子圖譜構建及性狀基因連鎖研究具有重要價。

關鍵詞:微齒菝葜;CDDP分子標記;體系優(yōu)化;引物篩選;多態(tài)性分析

Reaction System Optimization and Primer Screening ofCDDP - PCR and Polymorphism Analysis of Smilax microdontaZhang Qing, Zang DeKui

Abstract

In order to construct the optimal CDDP - PCR reaction system of Smilax microdonta, the or-thogonal experiment was designed with the factors of template DNA and primer concentration. The optimal sys-tem was established as follows : 2 x Es Taq MasterMix enzyme (containing dyes) 10 μL, 0.4μmol/L prim-er, 40 ng DNA template, and ddH20 supplemented t0 20 μL. A total of 12 primers with clear bands and goodpolymorphism were screened from 21 universal primers using the optimized system. One hundred and five sam-ples of Smilax microdonta were amplified with the screened primers, and 229 loci were obtained, of which 225were polymorphic loci, accounting for 98.25% of the total number of loci. This experiment demonstrated thatCDDP molecular markers were of great value for genetic diversity analysis, molecular map construction and studyon linkage of trait genes of Smilax microdonta.

Keywords Smilax microdonta; CDDP molecular marker; System optimization; Primer screening; Poly-morphism analysis

微齒菝葜(Smilax microdonta)為菝葜科菝葜屬落葉小灌木,零星分布于山東省棗莊市抱犢崮、湖北省神農架和江蘇省宜興市,與菝葜近緣[1]。菝葜屬植物在民間以根莖人藥,植株中含有甾體皂苷類、黃酮類、甾醇類、芪類和苯丙素等類型化合物,對心血管疾病的防治、免疫調節(jié)、抗菌抗炎、抗病毒、抗癌等具有良好的作用,臨床療效確切[2-4]。微齒菝葜形態(tài)與菝葜相似,在分類上易混淆[5],往往造成藥材的誤采、誤收、誤用等問題。近年來,因過度采挖,分布區(qū)旅游開發(fā)加上河流沖刷等自然條件干擾,微齒菝葜生境破壞嚴重,野生資源有所減少。因此對種質資源進行保護和遺傳多樣性研究十分必要。CDDP( conservedDNA - derived polymorphism)分子標記是Collard和Mackill在2009年開發(fā)的一種基于DNA保守序列的新型分子標記技術[6]。它針對植物功能基因或基因家族中保守氨基酸序列設計單條引物,可產生偏向候選功能基因區(qū)的顯性多態(tài)性標記,其PCR擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳即可分離,多態(tài)性豐富,穩(wěn)定性好。與隨機分子標記相比,CDDP分子標記可更有效地與目標性狀連鎖,具有操作便捷、應用成本低、引物設計簡單且通用性良好等優(yōu)點,在遺傳多樣性分析和分子標記輔助育種中具有重要的應用價值,前景較為廣闊[7]。目前CDDP分子標記已成功應用于大豆[8]、牡丹[9]、菊花[10]、越橘[ll]、野生玫瑰[12]和鐵皮石斛[13]等資源的遺傳多樣性分析、品種鑒定以及性狀關聯(lián)研究等方面。

由于微齒菝葜發(fā)現(xiàn)時間較晚,目前尚無相關的研究報道。本研究以山東省棗莊市分布的微齒菝葜為材料,利用正交試驗建立并優(yōu)化其CDDP -PCR反應體系,進而對該體系進行穩(wěn)定性驗證、篩選高效的CDDP引物、應用該分子標記分析微齒菝葜資源的多態(tài)性,以期為后續(xù)微齒菝葜遺傳多樣性分析和分子標記育種奠定基礎,同時為藥用資源的合理開發(fā)與應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

微齒菝葜分別采自山東省棗莊市抱犢崮景區(qū)、東莊和徐莊。采集無病蟲害和機械損傷的新鮮嫩葉,共105份樣品,經硅膠干燥,于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 總DNA提取 DNA提取參考改良CTAB法[14]并做相應改進。具體操作如下:取0.15~0.18g干燥葉片,加少許聚乙烯吡咯烷酮和抗壞血酸,液氮研磨成粉末后轉移至2mL離心管中,加入1mL預冷提取介質,混勻,4℃靜置10 min后離心,棄上清,重復2~3次,至上清液清透;加入50μL β-巰基乙醇、800μL預熱的CTAB緩沖液和10μL蛋白酶K溶液,顛倒混勻,65℃水浴th,并不時輕微振蕩;冷卻至室溫,加200 μLTris酚試劑、600 μL氯仿異戊醇(24:1),顛倒混勻10 min,40℃、12000 r/min離心10 min;轉移上清液至新離心管,加入等體積的氯仿異戊醇(24:1),輕輕顛倒混勻10 min,40C、12 000 r/min離心10 min,重復兩次該步驟;加50 μL 3 mol/L醋酸鈉,顛倒混勻,10 000 r/min離心5 min;加800 μL預冷無水乙醇,-20℃靜置30 min;4℃、12000 r/min離心3min;70%乙醇洗滌DNA沉淀3次,室溫干燥30min,加50μL TE溶解DNA。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性,Nano-drop 2000分光光度計測定純度和濃度,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

猜你喜歡
體系優(yōu)化
公司員工培訓體系優(yōu)化研究
物業(yè)管理公司員工培訓體系優(yōu)化研究
桃甲基化敏感擴增多態(tài)性MSAP技術體系的建立
供電公司人力資源培訓與開發(fā)體系優(yōu)化
正交設計優(yōu)化荷花品種ISSR—PCR反應體系
大花三色堇FPNI—PCR反應體系的優(yōu)化
新疆野核桃SRAP—PCR反應體系的優(yōu)化及引物篩選
楊梅iPBS—PCR反應體系的建立與優(yōu)化
綠水集團公司融資戰(zhàn)略體系優(yōu)化研究
羽衣甘藍SSR反應體系的優(yōu)化
滨州市| 龙里县| 门源| 博兴县| 高阳县| 平山县| 华坪县| 任丘市| 礼泉县| 诸暨市| 海南省| 长治县| 麻城市| 乌兰县| 甘南县| 临颍县| 永川市| 尼木县| 封开县| 雷州市| 瓮安县| 金塔县| 镇康县| 宜良县| 永仁县| 正阳县| 海城市| 交城县| 那曲县| 舒城县| 宿迁市| 手机| 十堰市| 沿河| 新乡县| 当雄县| 宽城| 探索| 乌兰县| 鄂托克前旗| 武宣县|