蔡志翔+沈志軍+嚴(yán)娟

摘要：為建立適合桃的甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（methylation sensitive amplification polymorphism，簡稱MSAP）反應(yīng)體系，以桃PCM-1R、PCM-1G為材料，對MSAP技術(shù)中的關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，500 ng基因組DNA用EcoRⅠ、HapⅡ或MspⅠ各10 U（0.5 μL，2 000 U/mL），37 ℃保溫12 h，即可酶切完全；25 μL選擇性擴(kuò)增體系中，含有2 μL 10倍稀釋的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物、各1 μL上下游引物、2.5 μL 10×Taq buffer、2.5 μL dNTP mix（各0.2 mmol/L）、2.5 μL 25 mmol/L MgCl2、0.25 μL Taq DNA聚合酶。在該體系下選用256對引物對桃葉片進(jìn)行甲基化模式分析，經(jīng)篩選獲得23對擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性好的引物，PCM-1R、PCM-1G總甲基化率分別為28.0%、25.7%。

關(guān)鍵詞：桃；DNA甲基化；MSAP；體系優(yōu)化

中圖分類號： S188；S662.101 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0043-03

DNA甲基化是真核細(xì)胞基因組主要的修飾方式之一，DNA甲基化特別是胞嘧啶甲基化具有表觀遺傳效應(yīng)和突變效應(yīng)，與基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化、基因組印記、性染色體失活及細(xì)胞記憶等生物學(xué)過程密切相關(guān)[1-4]。1995年，Vos等首次將隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性與限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性2種分子標(biāo)記有機(jī)結(jié)合[5]，建立了擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析技術(shù)。1997年，Gonzalgo等已經(jīng)嘗試用隨機(jī)引物和對甲基化敏感不同的同裂酶HpaⅡ、MspⅠ來進(jìn)行甲基化分析[3]。Xiong等于1999年首次證明甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（methylation sensitive amplification polymorphism，簡稱MSAP）是一種可靠的檢測植物DNA甲基化的方法[6]，它操作相對便捷，可檢測出樣品DNA中大量甲基化位點，因多態(tài)性高、引物設(shè)計簡單等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用。目前，MSAP方法在臍橙[7]、蘿卜[8]、雜交秈稻[9]、橡膠樹[10]、蘋果[11]等多種植物中都有應(yīng)用，但在桃的相關(guān)研究中尚未見應(yīng)用報道。PCM-1R（葉片紫紅色）、PCM-1G（葉片綠色）為PCM-1（葉片紫紅-綠雜色）的無性繁殖后代植株，本研究以這2個植株為試驗材料，建立桃MSAP體系，并進(jìn)行引物篩選，以期為進(jìn)一步研究桃DNA甲基化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

PCM-1R、PCM-1G，由國家果樹種質(zhì)南京桃資源圃提供。

1.2 儀器與試劑

主要儀器有Biometra T-Gradient PCR儀、Eppendorf 5810R冷凍離心機(jī)、BioRad電泳儀等。

主要試劑：EcoRⅠ、MspⅠ、HpaⅡ，New England BioLabs；Taq DNA聚合酶，Thermo Scientific；其他試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。接頭及引物由英濰捷基公司合成，詳見表1。

1.3 試驗方法

1.3.1 桃葉片DNA提取 桃葉片DNA提取參照王富榮等改良CTAB法[12]。

1.3.2 桃MSAP雙酶切體系優(yōu)化 20 μL體系：500 ng模板DNA，2 μL 10×NEB Buffer（EcoRⅠ/MspⅠ使用NEB4，EcoRⅠ/HpaⅡ使用NEB1），內(nèi)切酶EcoRⅠ/MspⅠ或HpaⅡ用量分為1、5、10、20 U 4種，用去離子水補(bǔ)足體積至20 μL。體系混勻后置于Biometra T-Gradient PCR儀上，分別于37 ℃溫育4、8、12、16、20 h，80 ℃失活20 min，取5 μL用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果，篩選出最佳酶切時間、最佳內(nèi)切酶用量。

接頭連接后進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。25 μL預(yù)擴(kuò)增體系：2.5 μL 10×Taq buffer，2.5 μL dNTP mix（各0.2 mmol/L），0.5 μmol/L 預(yù)擴(kuò)增引物E+A、H/M+T，2 μL模板DNA（連接產(chǎn)物稀釋10倍），2.5 μL 25 mmol/L MgCl2，0.25 μL 5 U/μL Taq DNA 聚合酶，用去離子水補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，36個循環(huán)；72 ℃ 15 min。

1.3.3 桃MSAP選擇性擴(kuò)增及引物的篩選 采用E+A**/H/M+T**引物組合。分別將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋5、10、20、50倍，對選擇性擴(kuò)增模板濃度進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)體系與預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系相同，擴(kuò)增程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s（每次循環(huán)降低0.7 ℃），72 ℃ 1 min，共13個循環(huán)；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共23個循環(huán)；72 ℃延伸15 min。

用優(yōu)化后的體系對E+A**、H/M+T**共256對引物進(jìn)行篩選。產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增效果。

1.3.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染 選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，95 ℃變性10 min，用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳；銀染參照梁宏偉等的方法[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，所提基因組DNA主帶清晰（圖1）。經(jīng)紫外分光光度測定，結(jié)果顯示D260 nm/D280 nm值在1.7～1.9范圍內(nèi)，說明DNA純度高，蛋白質(zhì)、多糖及酚類含量極少，滿足MSAP分析對DNA的要求。

2.2 桃MSAP雙酶切體系優(yōu)化

基因組DNA經(jīng)不同用量的內(nèi)切酶雙酶切，再用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2。由結(jié)果可知，對于20 μL體系、500 ng 模板DNA，1 U內(nèi)切酶用量酶切不完全，5、10、20 U內(nèi)切酶用量目測酶切完全，條帶差異不大。由于即使極少量的不完全酶切也會影響后續(xù)試驗，因此為徹底排除不完全酶切對后續(xù)試驗的影響且盡可能節(jié)約酶用量，對于20 μL體系，500 ng模板DNA選用10 U內(nèi)切酶。

基因組DNA經(jīng)不同酶切時間酶切，1%瓊脂糖電泳檢測結(jié)果顯示，對于20 μL體系、500 ng模板DNA、10 U內(nèi)切酶用量條件，不同酶切時間的效果表現(xiàn)為，酶切時間為4 h時，酶切不完全，8、12、16、20 h基本酶切充分且無明顯差異（圖3），為在保證酶切完全的前提下節(jié)省酶切時間，選擇酶切時間為12 h。

2.3 桃MSAP選擇性擴(kuò)增體系優(yōu)化

選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物于變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，結(jié)果表明，以20倍稀釋DNA為模板擴(kuò)增條帶更清晰，且小分子量條帶較易分辨，因此確定使用20倍稀釋的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。

2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果初步分析

用256對MSAP選擇性擴(kuò)增引物對桃PCM-1R、PCM-1G 的葉片DNA樣品進(jìn)行全基因組甲基化分析，篩選出23對條帶清晰、豐富且重復(fù)性好的引物組合（圖4）。擴(kuò)增出 200～1 000 bp的位點397個，其中PCM-1R、PCM-1G半甲基化位點分別為44、38個，分別占全部位點的11.1%、9.6%；全甲基化位點分別為67、64個，分別占全部位點的16.9%、16.1%；總甲基化率分別為28.0%、25.7%，PCM-1R略高于PCM-1G。

3 結(jié)論與討論

DNA在含有多糖、酚類和蛋白質(zhì)的情況下容易造成酶切失敗，體現(xiàn)在聚丙烯酰胺凝膠電泳膠版上端大分子片段多且背景加深[14]，因此高質(zhì)量的DNA是MSAP成功的基礎(chǔ)。一般來說，十二烷基硫酸鈉（SDS）法提取的DNA會有較多的多糖，使DNA呈膠凍狀，而CTAB法提取純化可基本除去多糖。桃葉片中糖及酚類物質(zhì)含量較多，因此本試驗采用王富榮等改良CTAB法提取基因組DNA[12]，雖然產(chǎn)量略低，但有效去除了蛋白質(zhì)、多糖及酚類雜質(zhì)，保證了DNA的質(zhì)量。

限制性內(nèi)切酶單位定義：在合適的溫度下，完全消化 1 μg DNA底物所需的酶量定義為1個單位（1 U）。在這個單位定義中，有幾個不確定因素：首先是底物，不同的酶單位定義選擇的底物可能不同；其次是限制性內(nèi)切酶在底物DNA上酶切位點的個數(shù)。酶單位定義要求完全消化，底物上某個酶的酶切位點數(shù)量的多少，直接影響該酶的單位定義。因而在進(jìn)行酶切時，用1 U酶消化1 μg DNA的通常做法是很不科學(xué)的，這也導(dǎo)致在實際工作中，要進(jìn)行多次試驗才能確定最合適的酶切條件。

研究表明，由于MSAP使用的同裂酶只能識別“CCGG/GGCC”位點的胞嘧啶甲基化，而不能對“CCGG/GGCC”位點以外的胞嘧啶甲基化進(jìn)行修飾，獲得的結(jié)果與基因組中實際的甲基化水平可能存在差異[15]。但由于約90%的甲基化修飾位于“CpG”二核苷酸或“CpNpG”三核苷酸重復(fù)區(qū)內(nèi)，因此多數(shù)研究者認(rèn)為“CCGG/GGCC”位點的甲基化修飾比例能夠客觀反映植物基因組甲基化修飾水平[16]。

不同物種或同一物種的不同生長時期、不同生長環(huán)境DNA甲基化水平有很大的差異，如臍橙甲基化率為4.7%～15.0%[7]，蘋果甲基化率為16.28%～21.77%[11]，半夏多倍體復(fù)合體甲基化率為54%～58%[17]，不同生態(tài)區(qū)同一基因型煙草甲基化率相差5.78百分點[18]。本試驗中的PCM-1R、PCM-1G均為3年生植株，且種植于同一田塊，基本上可以排除生長環(huán)境與樹齡對試驗結(jié)果的影響。

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