唐曉琴+唐紅+鄧飛+阮思蓓+李昕+陳波+楊朝鮮+熊小明+唐明希

[摘要]目的初步探討中期阿爾茨海默?。ˋD）的presenilin-1/presenilin-2雙基因條件性敲除小鼠（dKOmice）模型中海馬組織Atp5al基因的甲基化改變情況。方法運(yùn)用簡(jiǎn)化的表觀亞硫酸鹽測(cè)序技術(shù)（RRBS）檢測(cè)3只12月齡雌性dKO mice和3只同系同齡雌性野生型小鼠海馬組織基因組DNA異常甲基化情況，利用Bismark（v0.7.4）軟件進(jìn)行對(duì)照分析獲取異常甲基化基因。結(jié)果二代測(cè)序結(jié)果顯示12月齡中度神經(jīng)退行性病變AD dKO mice海馬中Atp5al基因呈低甲基化狀態(tài)（P<0.05）。結(jié)論Atp5al基因在中期ADdKO mice的海馬中呈低甲基化狀態(tài)，提示低甲基化的Atp5al基因可能作為參與中期AD病程的潛在候選基因。

[關(guān)鍵詞]Atp5al基因；阿爾茨海默病；DNA甲基化；dKO inlce

阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease，AD）是一種以進(jìn)行性記憶障礙及認(rèn)知功能減退為主要臨床表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，典型病理改變是大腦皮層和海馬細(xì)胞外主要由β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，A p）沉積形成的老年斑和tau蛋白過(guò)度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及遺傳因素、環(huán)境因素、成千上萬(wàn)個(gè)基因表達(dá)的改變及多種信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)，如Aβ的沉積、tau蛋白的過(guò)度磷酸化、氧化應(yīng)激、炎癥、能量代謝及細(xì)胞凋亡周期異常等。Mastroeni D等以同卵雙胞胎作為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)正常的和患AD的雙胞胎盡管遺傳基因相同，但是他們的表觀遺傳修飾卻不同，AD患者的雙顳側(cè)皮層神經(jīng)元中DNA甲基化水平顯著低于正常的同卵同胎，而且，其發(fā)病年齡、臨床表現(xiàn)和病程都相差很大。可見(jiàn)，表觀遺傳機(jī)制在AD的發(fā)病過(guò)程中扮演著十分重要的角色。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的開(kāi)展，AD相關(guān)基因的甲基化分析已經(jīng)取得一些進(jìn)展。本研究采用簡(jiǎn)化的表觀亞硫酸鹽測(cè)序技術(shù)（reduced representationbisulphite sequencing，RRBS）初步構(gòu)建起了中期AD dKO mice海馬組織基因組DNA甲基化圖譜，從中發(fā)現(xiàn)Atp5a1基因呈低甲基化狀態(tài)，可為后續(xù)進(jìn)一步驗(yàn)證并探討AD的表觀遺傳學(xué)機(jī)制提供潛在候選靶基因。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

美國(guó)Ya-Ping Tang教授（Louisiana State University，USA）為本實(shí)驗(yàn)提供了親代小鼠（基因型為fPSl/fPSl，PS2-/-，Cre+/-），其遺傳背景為B6CBAFl，是利用Cre/loxP系統(tǒng)條件性敲除前腦presenilin-1（PS1）基因，所得雜合子與利用基因打靶技術(shù)將presenilin-2（PS2）基因進(jìn)行全身性敲除所得雜合子雜交而來(lái)。子代dKO mice的飼養(yǎng)、繁殖與基因型鑒定等如我們已報(bào)道所述。實(shí)驗(yàn)分組：12月齡雌性dKOmice（體重=35.0±2.6g）和同齡雌性野生型小鼠（體重=37.0±1.8g）各3只用于RRBS測(cè)序檢測(cè)。

1.1.2海馬組織的準(zhǔn)備（1）乙醚麻醉后快速斷頸處死實(shí)驗(yàn)小鼠；（2）用組織剪剪開(kāi)皮毛，暴露頭骨；（3）更換剪刀撥開(kāi)顱骨，暴露全腦；（4）用眼科剪剝離全腦組織，轉(zhuǎn)移至放于碎冰上的無(wú)菌平皿中；（5）用手術(shù)刀沿矢狀縫把左右半球分開(kāi)，迅速分離海馬組織，裝入已標(biāo)記好的凍存管中，用封口膠封口，置于液氮罐中約30min后，轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中保存。

1.2方法

1.2.1 DNA提取TIANamp DNA提取試劑盒（貨號(hào)DP304）購(gòu)自天根生化科技有限公司。提取海馬組織基因組DNA主要步驟包括：（1）將組織處理成細(xì)胞懸液；（2）裂解：在變性條件下用蛋白酶K裂解樣本；（3）吸附：DNA吸附于純化柱中的硅膠膜上；（4）清洗：將硅膠膜上吸附的蛋白、脂質(zhì)等雜質(zhì)洗掉；（5）洗脫：利用洗脫液TE將高純度的DNA從硅膠膜上洗脫。運(yùn)用紫外分光光度計(jì)測(cè)量OD值（0D260/280和0D260/230）和0.8%瓊脂糖凝膠電泳（100V，40min）進(jìn)行DNA質(zhì)量檢測(cè)。

1.2.2RRBS測(cè)序?qū)⒓兓蟮腄NA提交到杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司進(jìn)行甲基化譜RRBS測(cè)序（Illumina HiSeq 2500）。RRBS測(cè)序原理：運(yùn)用限制性內(nèi)切酶MsPI處理基因組DNA，產(chǎn)生末端包含CpG二核苷酸的片段后，在末端修復(fù)并加A尾和接頭，根據(jù)大?。?0-220bp）選擇CpG豐富DNA片段，經(jīng)重亞硫酸鹽處理及PCR擴(kuò)增后使用Illumina基因組分析儀進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序完成后，采用NGSQCToolkit_v2.3軟件進(jìn)行測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制，將5%以上堿基質(zhì)量數(shù)低于30的序列過(guò)濾掉，并在Bismark（v0.7.4）軟件中將過(guò)濾后的高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到小鼠參考基因組序列上，分別計(jì)算每個(gè)樣本Atp5al基因發(fā)生甲基化的碳（C）數(shù)比上總C數(shù)而得到其相對(duì)甲基化水平，再提取6個(gè)樣本的相對(duì)甲基化水平，采用edgeR軟件進(jìn)行差異分析，獲得異常甲基化基因。發(fā)生甲基化的篩選標(biāo)注為P<0.05。

2結(jié)果

2.1海馬組織DNA質(zhì)量鑒定結(jié)果

經(jīng)紫外線分光光度計(jì)測(cè)定，用于RRBS檢測(cè)的海馬組織基因組DNA樣品滿足：0D260/280≥1.8，0D260/230≥1.5（表1）。將提取的DNA進(jìn)行0.8%瓊脂糖電泳檢測(cè)（100V，40min），結(jié)果顯示：DNA樣品電泳條帶完整清晰，符合RRBS檢測(cè)及單基因甲基化檢測(cè)要求（圖1）。

2.2Atp5a1基因甲基化篩選結(jié)果

RRBS檢測(cè)完成后，利用Bismark（v0.7.4）軟件同小鼠參考基因組序列進(jìn)行對(duì)比分析，篩選出異常甲基化基因Atp5a1呈低甲基化狀態(tài)。如表2所示，Atp5a1基因位于第十八號(hào)染色體外顯子起始位點(diǎn)為77778732，終止位點(diǎn)為77778899，通過(guò)Bismark（v0.7.4）軟件中將過(guò)濾后的高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到小鼠參考基因組序列上，利用實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組測(cè)序結(jié)果，采取edger軟件進(jìn)行相對(duì)甲基化率差異分析，獲得異常甲基化基因Atp5a1（P<0.05）。

3討論

隨著人口老齡化的日益加重，對(duì)AD發(fā)病機(jī)制的研究也越來(lái)越緊迫。流行病學(xué)調(diào)查顯示，2014年用于護(hù)理患AD和其他癡呆患者的費(fèi)用超過(guò)2170億美元，預(yù)計(jì)到2015年用于65歲及以上AD患者的衛(wèi)生保健、長(zhǎng)期護(hù)理和臨終關(guān)懷等服務(wù)的總費(fèi)用將達(dá)2260億美元。目前，每67秒就會(huì)有一個(gè)人被診斷為AD患者，預(yù)計(jì)到2050年，這個(gè)時(shí)間將縮短為33秒，每年將導(dǎo)致近100萬(wàn)新發(fā)病例。顯然，AD已經(jīng)成為一個(gè)舉世矚目的社會(huì)和醫(yī)學(xué)問(wèn)題。dKO mice模型已被證實(shí)具有AD樣神經(jīng)退行性疾病的典型表型，如大腦皮質(zhì)和海馬萎縮、側(cè)腦室和第三腦室擴(kuò)大、嚴(yán)重神經(jīng)元的損失、神經(jīng)膠質(zhì)過(guò)多癥、tau蛋白的過(guò)度磷酸化、學(xué)習(xí)和記憶功能喪失等。該動(dòng)物模型容易存活、飼養(yǎng)和繁殖，于2個(gè)月齡時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)輕度記憶障礙，6個(gè)月齡時(shí)大腦皮層明顯變薄，皮層神經(jīng)元丟失達(dá)18%左右；12月齡時(shí)表現(xiàn)出中期AD樣表型。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用RRBS測(cè)序檢測(cè)12月齡dKO mice和野生型小鼠海馬組織中基因組DNA異常甲基化分布情況，利用相關(guān)生物軟件對(duì)照分析，發(fā)現(xiàn)了存在于第十八號(hào)染色體外顯子的Atp5al（ATP synthase-a）基因呈低甲基化狀態(tài)。

Atp5a1基因編碼的是ATP合成酶的a-亞基，ATP合成酶廣泛分布于線粒體內(nèi)膜上，負(fù)責(zé)將呼吸鏈中的ADP合成為ATP，Atp5a1基因缺失將導(dǎo)致該酶失活，使細(xì)胞凋亡。研究表明，Atp5a1在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常，如在結(jié)直腸癌的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)減少，而在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、食管癌的腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)。此外，Seth R等還發(fā)現(xiàn)高水平的Atp5al表達(dá)與某些單核苷酸多態(tài)性（SNPs）和TP53突變有關(guān)，能促進(jìn)宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）的發(fā)生，從而發(fā)展為腫瘤，而Atp5a1低水平的表達(dá)可能促進(jìn)基因的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）腫瘤的發(fā)生。目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)該基因在AD發(fā)生機(jī)制中的研究報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)RRBS測(cè)序結(jié)果顯示，Atp5a1基因在12月齡dKO mice的海馬中呈低甲基化狀態(tài)，初步提示中期AD dKO mice模型的病理過(guò)程中低甲基化的Atp5a1基因可能發(fā)揮著一定作用。但由于本實(shí)驗(yàn)?zāi)壳皟H限于二代測(cè)序結(jié)果，研究樣本量又有限，要進(jìn)一步確定Atp5a1基因是否真正參與到中期AD dKO mice的病程，還需進(jìn)一步采用甲基化特異性PCR、單基因甲基化測(cè)序、RT-PCR、免疫組化及免疫印跡等方法進(jìn)一步驗(yàn)證并分析該基因甲基化狀態(tài)、轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平等改變等情況，并將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，且結(jié)合早期及晚期dKO mice相應(yīng)基因甲基化改變情況進(jìn)行對(duì)比分析，為全面了解Vps33b基因的甲基化狀態(tài)在中期AD中的生物學(xué)功能提供候選基因。

綜上所述，RRBS測(cè)序結(jié)果初步顯示Atp5a1基因在中度神經(jīng)退行性病變AD dKO mice的病理進(jìn)程中呈低甲基化狀態(tài)，為進(jìn)一步證實(shí)、篩選及研究AD發(fā)生的表觀遺傳機(jī)制、病理進(jìn)程，以及AD基因靶向預(yù)防、治療、預(yù)后判斷等提供重要的候選線索。