劉暢+祝朋芳+房霞+康耀海+趙穎

摘要：為優(yōu)化羽衣甘藍(lán)（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ． ａｃｅｐｈａｌａ）ＳＳＲ反應(yīng)體系，并利用優(yōu)化的體系進(jìn)行引物的篩選。采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)篩選各反應(yīng)因素的最佳水平，并采用Ｌ１６（４５）正交設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化，建立了羽衣甘藍(lán)ＳＳＲ－ＰＣＲ最佳反應(yīng)體系。結(jié)果表明，各因素不同水平濃度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果均有一定影響，羽衣甘藍(lán)基因組ＤＮＡ的最佳ＳＳＲ反應(yīng)體系為ＤＮＡ模板量（５０ ｎｇ／μＬ）１．０ μＬ，１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ １．０ μＬ，引物量（２．０ μｍｏｌ／Ｌ）上下游各３．０ μＬ，ｄＮＴＰｓ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）０．８ μＬ，Ｔａｑ聚合酶（５ Ｕ／μＬ）０．２ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ １．０ μＬ，總體積１０ μＬ。檢測了優(yōu)化體系的穩(wěn)定性，利用優(yōu)化的反應(yīng)體系對(duì)蕓薹屬植物 ２０對(duì)ＳＳＲ引物進(jìn)行擴(kuò)增并用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，在所選用的２０對(duì)引物中，１８對(duì)擴(kuò)增出了清晰的條帶，１１對(duì)具有特異擴(kuò)增條帶，多態(tài)性引物比率為６１％，驗(yàn)證了該體系可用于羽衣甘藍(lán)ＳＳＲ－ＰＣＲ擴(kuò)增和ＳＳＲ引物的篩選。

關(guān)鍵詞：羽衣甘藍(lán)（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ． ａｃｅｐｈａｌａ）；ＳＳＲ；正交設(shè)計(jì)；體系優(yōu)化

中圖分類號(hào)：Ｓ６３５．９文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０14）09－2079-04

Optimizing SSR System of Brassica oleracea var. acephala

ＬＩＵ Ｃｈａｎｇ１，ＺＨＵ Ｐｅｎｇ－ｆａｎｇ１，ＦＡＮＧ Ｘｉａ１，ＫＡＮＧ Ｙａｏ－ｈａｉ１，ＺＨＡＯ Ｙｉｎｇ１，２

（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０８６６， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｕｒｂａｎ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０１２２， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ＳＳＲ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ． ａｃｅｐｈａｌａ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒｓ． Ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ｒａｎｄｏｍ ｄｅｓｉｇｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ＳＳＲ－ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｔｈｅ Ｌ１６（４５） ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｅａｃｈ ｆａｃｔｏｒ ｈａｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ＰＣＲ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｓｙｓｔｅｍ ｗａｓ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ（５０ ｎｇ／μＬ） １．０ μＬ， １０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ１．０ μＬ， ２．０ μｍｏｌ／Ｌ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｐｒｉｍｅｒ ａｎｄ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ３．０ μＬ ｅａｃｈ， ｄＮＴＰｓ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）０．８ μＬ， Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μＬ） ０．２ μＬ ａｎｄ ｄｄＨ２Ｏ １．０ μＬ． Ｔｗｅｎｔｙ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｔｅｓｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｂｙ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ． Ｅｉｇｈｔｅｅｎ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｈａｄ ｃｌｅａｒ ｂａｎｄｓ ａｎｄ ｅｌｅｖｅｎ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ， ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ６１％． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ＳＳＲ－ＰＣＲ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ． ａｃｅｐｈａｌａ； ＳＳＲ； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ； ｓｙｓｔｅｍ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ

羽衣甘藍(lán)（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ． ａｃｅｐｈａｌａ）是十字花科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）蕓薹屬（Ｂｒａｓｓｉｃａ）觀賞植物，又名葉牡丹，觀賞價(jià)值高，耐寒性強(qiáng)。開展羽衣甘藍(lán)遺傳育種相關(guān)研究工作是其應(yīng)用的關(guān)鍵，由于我國近十幾年才開始引種栽培羽衣甘藍(lán)，目前較多的研究集中在組織培養(yǎng)及主要園藝性狀的初步遺傳規(guī)律分析等方面。

分子標(biāo)記技術(shù)目前已成為現(xiàn)代遺傳學(xué)研究的重點(diǎn)，在諸如ＳＲＡＰ、ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＳＳＲ、ＡＦＬＰ等諸多分子標(biāo)記中，ＳＳＲ標(biāo)記基于ＰＣＲ，操作安全簡單，多態(tài)性好，穩(wěn)定性強(qiáng)，且多數(shù)為共顯性［１，２］，是優(yōu)良的基因組特異標(biāo)記類型，近年來在蕓薹屬植物上得到了較廣泛的開發(fā)。近緣屬植物相關(guān)研究中，ＳＳＲ標(biāo)記主要集中在油菜、甘藍(lán)、白菜等作物中，目前尚未見羽衣甘藍(lán)ＳＳＲ反應(yīng)體系優(yōu)化的相關(guān)研究。關(guān)于植物分子標(biāo)記反應(yīng)體系優(yōu)化方面的研究，國內(nèi)以采用正交試驗(yàn)獲得最優(yōu)反應(yīng)體系較多［３－１１］。為此，在前人相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，對(duì)羽衣甘藍(lán)ＳＳＲ－ＰＣＲ反應(yīng)體系進(jìn)行了研究，得到了一套適合于羽衣甘藍(lán)基因組ＤＮＡ擴(kuò)增的反應(yīng)體系，為后續(xù)相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

１材料與方法

１．１材料

以羽衣甘藍(lán)自交系為試材。ｄＮＴＰｓ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／μＬ）、１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（含Ｍｇ２＋）、Ｄ２０００ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ等分子生物學(xué)試劑購于天根生化科技有限公司。采用ＣＴＡＢ法［１２，１３］提取羽衣甘藍(lán)基因組ＤＮＡ， 用１％的瓊脂糖凝膠檢測ＤＮＡ質(zhì)量，－２０ ℃保存用于ＰＣＲ擴(kuò)增。

１．２ＳＳＲ擴(kuò)增反應(yīng)體系的優(yōu)化

ＳＳＲ引物根據(jù)蕓薹屬基因庫信息源（ＢＲＡＤ，ｔｈｅ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｄａｔａｂａｓｅ，ｈｔｔｐ：／／ｂｒａｓｓｉｃａｄｂ．ｏｒｇ）公告的蕓薹屬作物引物序列，由金斯瑞生物工程技術(shù)有限公司合成。

ＳＳＲ反應(yīng)體系總體積１０ μＬ，包括５０ ｎｇ／μＬ的模板ＤＮＡ，１０×Ｂｕｆｆｅｒ，２ μｍｏｌ／Ｌ的引物，２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰｓ及５Ｕ／μＬ的Ｔａｑ聚合酶。為了確定這５個(gè)因素在ＰＣＲ反應(yīng)中的最佳水平，采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，運(yùn)用引物ＢＮ１２Ａ進(jìn)行擴(kuò)增。引物ＢＮ１２Ａ序列：５′端Ｆｏｒｗａｒｄ：５′－ＧＣＣＧＴＴＣＴＡＧＧＧＴＴＴ

ＧＴＧＧＧＡ－３′， Ｔｍ：４９．５９ ℃； ３′端Ｒｅｖｅｒｓｅ：５′－ＧＡＧＧＡ

ＡＧＴＧＡＧＡＧＣＧＧＧＡＡＡＴＣＡ－３′，Ｔｍ：５２．３７ ℃。單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)選取了5個(gè)因素，各因素均設(shè)４個(gè)水平，逐個(gè)優(yōu)化其他反應(yīng)成分的水平，以確定相對(duì)較優(yōu)的因素組合。該部分試驗(yàn)中，逐一研究反應(yīng)體系中１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、模板ＤＮＡ、ｄＮＴＰｓ及引物的用量對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響。即當(dāng)針對(duì)某種組分進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，其他組分的用量不變。

Ｌ１６（４５）正交試驗(yàn)因素與水平見表１，ＰＣＲ反應(yīng)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表２。

１．３擴(kuò)增產(chǎn)物和反應(yīng)體系穩(wěn)定性的檢測

ＳＳＲ反應(yīng)程序?yàn)椋海梗?℃預(yù)變性３ ｍｉｎ，９４ ℃變性４５ ｓ，４０～５５ ℃（需根據(jù)Ｔｍ值確定）復(fù)性４５ ｓ，７２ ℃延伸４５ ｓ，３５個(gè)循環(huán)；７２ ℃延伸７ ｍｉｎ；４ ℃保存。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入４ μＬ ＰＣＲ產(chǎn)物和１ μＬ ６×Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ混勻，２．０％的瓊脂糖凝膠檢測?；蛏蠘樱?μＬ于５％的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，在１×ＴＢＥ的電極緩沖液中電泳檢測，采用銀染法染色。

選用２０對(duì)ＳＳＲ引物優(yōu)化后的最佳反應(yīng)體系、反應(yīng)程序進(jìn)行ＳＳＲ反應(yīng)體系穩(wěn)定性檢測。

２結(jié)果與分析

２．１羽衣甘藍(lán)基因組ＤＮＡ質(zhì)量檢測

將提取的羽衣甘藍(lán)基因組ＤＮＡ經(jīng)分光光度計(jì)檢測，發(fā)現(xiàn)其ＯＤ２６０ ｎｍ／ＯＤ２８０ nｍ均在１．８～２．０之間，又經(jīng)１％瓊脂糖凝膠電泳檢測，ＤＮＡ呈現(xiàn)一條亮帶，條帶清晰，無明顯的拖尾現(xiàn)象（圖１），說明提取的ＤＮＡ純度均一。純度和濃度檢測結(jié)果相互驗(yàn)證，說明提取的ＤＮＡ合格，可以滿足后續(xù)的ＰＣＲ反應(yīng)要求，為下一步的ＰＣＲ擴(kuò)增篩選ＳＳＲ引物提供了有力的保障。

２．２羽衣甘藍(lán)ＳＳＲ反應(yīng)體系的優(yōu)化

２．２．1單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)篩選結(jié)果由圖2 可知，ｄＮＴＰｓ的體積在０．４～０．８ μＬ時(shí)擴(kuò)增效果比較好，可擴(kuò)增出清晰的條帶，其中以０．８ μＬ的ｄＮＴＰｓ擴(kuò)增出的特異性條帶最多且最清晰。當(dāng)ｄＮＴＰｓ體積達(dá)到１．０ μＬ時(shí)擴(kuò)增出的條帶很少且很淺不清晰，可能是由于高濃度ｄＮＴＰｓ易與Ｔａｑ酶競爭，結(jié)合了Ｍｇ２+，降低了酶活性；而ｄＮＴＰｓ濃度低時(shí)，影響擴(kuò)增產(chǎn)物形成，擴(kuò)增量少，條帶較弱。

從圖3可以看出，ＤＮＡ模板量在０．５～１．０ μＬ時(shí)，對(duì)ＳＳＲ的擴(kuò)增沒有明顯的影響，但１．０ μＬ的ＤＮＡ模板擴(kuò)增出的條帶要比０．５ μＬ的ＤＮＡ模板擴(kuò)增出的特異性條帶多且清晰。但當(dāng)ＤＮＡ模板量大于１．５ μＬ時(shí)，ＳＳＲ擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)了非特異性的擴(kuò)增條帶且雜帶較多。

從圖4可以看出，Taq DNA聚合酶的體積為0.1 μL時(shí)特異性條帶很淡，在0.2~0.4 μL時(shí)擴(kuò)增的帶型較穩(wěn)定且清晰。而當(dāng)Taq DNA聚合酶的體積為0.6 μL時(shí)出現(xiàn)了較淡的非特異性條帶。

從圖５可以看出，１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ的體積在１．０～１．５ μＬ時(shí)條帶較清晰明顯，但１．０ μＬ的１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ的特異性條帶要比１．５ μＬ的亮。相反，當(dāng)１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ體積大于２．０ μＬ時(shí)，擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)了較淡的非特異性條帶。

從圖６可以看出，當(dāng)引物量較低（小于２.0 μＬ）時(shí)擴(kuò)增出的條帶很少，當(dāng)引物量在２．５~3.0μＬ時(shí)擴(kuò)增出的條帶較多，尤其引物量為３.0 μＬ時(shí)擴(kuò)增出的條帶更清晰。由此應(yīng)選用３.0 μＬ左右的引物用量。

２．２．2正交試驗(yàn)結(jié)果按照表２的１６個(gè)組合進(jìn)行ＰＣＲ反應(yīng)后的電泳結(jié)果見圖7。從圖7可以看出，在１６個(gè)處理組合中，由于Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、模板ＤＮＡ、ｄＮＴＰｓ和引物５個(gè)因素的用量不同， 擴(kuò)增的效果存在明顯的差異。組合１、２基本沒有條帶，組合３、４、６、１２條帶較少且較淡，組合５條帶最多且很清晰。為了能擴(kuò)增出清晰度高、穩(wěn)定性強(qiáng)的條帶， 選用組合５為最佳反應(yīng)體系，即ＤＮＡ模板量（５０ ｎｇ／μＬ）１．０ μＬ，１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ １．０ μＬ，引物量（２．０ μｍｏｌ／Ｌ）上下游各３．０ μＬ， ｄＮＴＰｓ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）０．８ μＬ，Ｔａｑ聚合酶（５ Ｕ／μＬ）０．２ μＬ。

綜合單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)和正交試驗(yàn)的結(jié)果，認(rèn)為適合羽衣甘藍(lán)基因組ＤＮＡ的最佳ＳＳＲ反應(yīng)體系為：ＤＮＡ模板量（５０ ｎｇ／ μＬ）１．０ μＬ，１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ１．０ μＬ，引物量（２．０ μｍｏｌ／Ｌ）上下游各３．０ μＬ，ｄＮＴＰｓ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）０．８ μＬ，Ｔａｑ聚合酶（５ Ｕ／μＬ）０．２ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ １．０ μＬ。

２．３ＳＳＲ反應(yīng)體系穩(wěn)定性的檢測

采用分辨率更高的聚丙烯酰胺凝膠，利用上述構(gòu)建的最優(yōu)反應(yīng)體系，在所選用的２０對(duì)引物中，１８對(duì)引物能擴(kuò)增出清晰的條帶（圖8），篩選出具有特異擴(kuò)增條帶的ＳＳＲ引物１１對(duì)，多態(tài)性引物占有率為６１％。由此認(rèn)為，上述建立的ＳＳＲ－ＰＣＲ反應(yīng)體系穩(wěn)定性較好，適合于羽衣甘藍(lán)基因組ＤＮＡ的擴(kuò)增。

３小結(jié)與討論

ＳＳＲ體系的優(yōu)化是以其ＰＣＲ擴(kuò)增能力為尺度對(duì)模板ＤＮＡ或其他因素進(jìn)行調(diào)整，從而獲得最佳的擴(kuò)增能力。ＳＳＲ－ＰＣＲ對(duì)反應(yīng)條件的變化比較敏感，外界因素的不同會(huì)使ＳＳＲ的擴(kuò)增結(jié)果不同。ＰＣＲ反應(yīng)是由耐高溫的Ｔａｑ酶催化，但不同公司生產(chǎn)的不同質(zhì)量的Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶的擴(kuò)增效果會(huì)有一定差異，從而導(dǎo)致Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶的最佳用量也不會(huì)完全一樣。試驗(yàn)中所用的Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶為天根生化科技有限公司生產(chǎn)，從一定程度上保證了關(guān)鍵因子的一致性。在ＳＳＲ擴(kuò)增反應(yīng)中Ｍｇ２＋主要來源于Ｂｕｆｆｅｒ，由于本研究所采用的與Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶配套，使用的１０×Ｂｕｆｆｅｒ中已含ＭｇＣｌ２， 因而Ｍｇ２＋濃度被固定，并未對(duì)其中所含的Ｍｇ２＋的最適宜濃度進(jìn)行研究，這與前人的研究有所不同。

試驗(yàn)中除Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、１０×ＰＣＲ Bｕｆｆｅｒ、模板ＤＮＡ、ｄＮＴＰｓ和引物等主要因素外，所使用的儀器、試劑、操作手法等因素也會(huì)對(duì)反應(yīng)體系造成影響。為保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，是在一致的試驗(yàn)條件下完成的，一定程度上保證了反應(yīng)體系的統(tǒng)一和穩(wěn)定性，從而有利于提高試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，為后續(xù)試驗(yàn)如多態(tài)性引物篩選、特異性標(biāo)記的獲得等打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

ＳＳＲ－ＰＣＲ反應(yīng)體系的獲得主要以單因素、完全試驗(yàn)、正交試驗(yàn)３種方法為主。相比較而言，單因素獲得的反應(yīng)體系方法簡單易行，需進(jìn)行多次的單因素梯度試驗(yàn)，忽略了各因素間的交互作用。完全試驗(yàn)考慮到了所有的組合方式，但試驗(yàn)組合數(shù)較多，工作量較大，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。多因素的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，利用正交表的均衡分散性和整齊可比性，既能減少試驗(yàn)規(guī)模又能快速地找出最優(yōu)的反應(yīng)體系，是篩選ＰＣＲ反應(yīng)的一種有效方法［１３－１５］。試驗(yàn)首先用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)大范圍識(shí)別SSR反應(yīng)體系中的關(guān)鍵影響因素的用量，再利用正交設(shè)計(jì)確定其最適用量。單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)的單因素因子不會(huì)影響其他因子評(píng)價(jià)，但也不能兼顧各因素間的交互作用，所以需先用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)大范圍確定影響因素的用量再用正交試驗(yàn)確定其最佳用量。試驗(yàn)采用了單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)兩種方法，但對(duì)于結(jié)果的判斷通過直觀的電泳圖譜進(jìn)行定性或評(píng)分法對(duì)各處理體系進(jìn)行篩選也存在一定的主觀性，因此也缺乏一定的可靠性。

在獲得最佳反應(yīng)體系后，要檢測反應(yīng)體系的穩(wěn)定性以驗(yàn)證反應(yīng)體系是否為最佳。試驗(yàn)繼而選用２０對(duì)引物，利用以上優(yōu)化后的反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，獲得了９０％的擴(kuò)增率。此外，利用不同的ＳＳＲ引物檢測多態(tài)性時(shí)，由于不同引物的Ｔｍ不同，因而采用的最適Ｔｍ也不同，試驗(yàn)中可參考引物設(shè)計(jì)合成時(shí)的退火溫度或通過梯度ＰＣＲ儀篩選引物的最佳退火溫度。試驗(yàn)建立的一套完善的適用于羽衣甘藍(lán)的ＳＳＲ標(biāo)準(zhǔn)體系，將有助于為羽衣甘藍(lán)重要性狀分子標(biāo)記的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

［１］ ＭＯＲＧＡＮＴＥ Ｍ， ＯＬＩＶＩＥＲＩ Ａ Ｍ． ＰＣＲ－ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ａｓ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃｓ［Ｊ］． Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９３，３（１）：１７５－１８２．

［２］ ＢＥＬＬ Ｃ Ｊ，ＥＣＫＥＮ Ｊ Ｒ． Ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ３０ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｌｏｃｉ ｔｏ ｔｈｅ ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９４，１９（１）：１３７－１４４．

［３］ 馮富娟，趙丹，孫曉艷，等．紅松ＳＳＲ－ＰＣＲ反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化［Ｊ］．經(jīng)濟(jì)林研究，２０１０，２８（１）：３５－４０．

［４］ 郭海林，王志勇，薛丹丹，等．結(jié)縷草屬植物ＳＳＲ反應(yīng)體系的優(yōu)化及其應(yīng)用［Ｊ］．植物遺傳資源學(xué)報(bào)，２００８，９（２）：１３８－１４３．

［５］ 李亞利，陳書霞，孟煥文，等．利用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化黃瓜的ＳＳＲ－ＰＣＲ反應(yīng)體系［Ｊ］．西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，２００８，１７（３）：２８０－２８４．

［６］ 朱世楊，羅天寬，張小玲，等．水稻ＳＳＲ－ＰＣＲ反應(yīng)體系的優(yōu)化［Ｊ］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，２００９，３７（８）：３４４１－３４４３，３４４７．

［７］ 史公軍，侯喜林．不結(jié)球白菜ＲＡＰＤ反應(yīng)體系的優(yōu)化［Ｊ］．江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，２００４，２６（１）：１－５．

［８］ 王彥華，侯喜林，徐明宇．正交設(shè)計(jì)優(yōu)化不結(jié)球白菜ＩＳＳＲ反應(yīng)體系研究［Ｊ］．西北植物學(xué)報(bào)，２００４，２４（５）：８９９－９０２．

［９］ 楊琦，張魯剛．大白菜ＳＲＡＰ反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化［Ｊ］．西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，２００７，１６（３）：１１９－１２３．

［１０］ 徐瑩瑩，屈淑平，崔崇士．大白菜ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反應(yīng)體系的優(yōu)化［Ｊ］．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，２００８，３９（８）：３１－３４．

［１１］ 石磊，李麗，鄭曉鷹．大白菜ＳＳＲ檢測體系的優(yōu)化［Ｊ］．分子植物育種，２００７，５（１）：１１０－１１６．

［１２］ 曹家樹，曹壽椿，易清明．白菜及其相鄰類群基因組ＤＮＡ的ＲＡＰＤ分析［Ｊ］．園藝學(xué)報(bào)，１９９５，２２（１）：４７－５２．

［１３］ ＤＩＥＴＥＲＩＣＨ Ｊ Ｈ， ＢＲＡＵＮ Ｈ Ｐ， ＳＣＨＭＩＴＺ Ｕ Ｋ． Ａｌｌｏｐｌａｓｍｉｃ ｍａｌｅ ｓｔｅｒｉｌｅ ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（ＣＭＳ Ｔｏｕｒｎｅｆｏｒｔｉｉ－Ｓｔｉｅｗｅ） ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｓｐｅｃｉａｌ ｇｅｎｅ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ａｒｏｕｄ ａ ｎｏｖｅｌ ａｔｐ９ ｇｅｎｅ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍ，２００３，２６９（６）：７２３－７３１．

［１４］ 謝文剛，張新全，彭燕，等．鴨茅ＳＳＲ－ＰＣＲ反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選［Ｊ］．分子植物育種，２００８，６（２）：３８１－３８６．

［１５］ 王乃坤，江樹華，曲志程．正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法在試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的應(yīng)用［Ｊ］．黑龍江交通科技，２００３（８）：８９－９０．

［３］ 馮富娟，趙丹，孫曉艷，等．紅松ＳＳＲ－ＰＣＲ反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化［Ｊ］．經(jīng)濟(jì)林研究，２０１０，２８（１）：３５－４０．

［４］ 郭海林，王志勇，薛丹丹，等．結(jié)縷草屬植物ＳＳＲ反應(yīng)體系的優(yōu)化及其應(yīng)用［Ｊ］．植物遺傳資源學(xué)報(bào)，２００８，９（２）：１３８－１４３．

［５］ 李亞利，陳書霞，孟煥文，等．利用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化黃瓜的ＳＳＲ－ＰＣＲ反應(yīng)體系［Ｊ］．西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，２００８，１７（３）：２８０－２８４．

［６］ 朱世楊，羅天寬，張小玲，等．水稻ＳＳＲ－ＰＣＲ反應(yīng)體系的優(yōu)化［Ｊ］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，２００９，３７（８）：３４４１－３４４３，３４４７．

［７］ 史公軍，侯喜林．不結(jié)球白菜ＲＡＰＤ反應(yīng)體系的優(yōu)化［Ｊ］．江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，２００４，２６（１）：１－５．

［８］ 王彥華，侯喜林，徐明宇．正交設(shè)計(jì)優(yōu)化不結(jié)球白菜ＩＳＳＲ反應(yīng)體系研究［Ｊ］．西北植物學(xué)報(bào)，２００４，２４（５）：８９９－９０２．

［９］ 楊琦，張魯剛．大白菜ＳＲＡＰ反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化［Ｊ］．西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，２００７，１６（３）：１１９－１２３．

［１０］ 徐瑩瑩，屈淑平，崔崇士．大白菜ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反應(yīng)體系的優(yōu)化［Ｊ］．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，２００８，３９（８）：３１－３４．

［１１］ 石磊，李麗，鄭曉鷹．大白菜ＳＳＲ檢測體系的優(yōu)化［Ｊ］．分子植物育種，２００７，５（１）：１１０－１１６．

［１２］ 曹家樹，曹壽椿，易清明．白菜及其相鄰類群基因組ＤＮＡ的ＲＡＰＤ分析［Ｊ］．園藝學(xué)報(bào)，１９９５，２２（１）：４７－５２．

［１３］ ＤＩＥＴＥＲＩＣＨ Ｊ Ｈ， ＢＲＡＵＮ Ｈ Ｐ， ＳＣＨＭＩＴＺ Ｕ Ｋ． Ａｌｌｏｐｌａｓｍｉｃ ｍａｌｅ ｓｔｅｒｉｌｅ ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（ＣＭＳ Ｔｏｕｒｎｅｆｏｒｔｉｉ－Ｓｔｉｅｗｅ） ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｓｐｅｃｉａｌ ｇｅｎｅ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ａｒｏｕｄ ａ ｎｏｖｅｌ ａｔｐ９ ｇｅｎｅ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍ，２００３，２６９（６）：７２３－７３１．

［１４］ 謝文剛，張新全，彭燕，等．鴨茅ＳＳＲ－ＰＣＲ反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選［Ｊ］．分子植物育種，２００８，６（２）：３８１－３８６．

［１５］ 王乃坤，江樹華，曲志程．正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法在試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的應(yīng)用［Ｊ］．黑龍江交通科技，２００３（８）：８９－９０．

［３］ 馮富娟，趙丹，孫曉艷，等．紅松ＳＳＲ－ＰＣＲ反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化［Ｊ］．經(jīng)濟(jì)林研究，２０１０，２８（１）：３５－４０．

［４］ 郭海林，王志勇，薛丹丹，等．結(jié)縷草屬植物ＳＳＲ反應(yīng)體系的優(yōu)化及其應(yīng)用［Ｊ］．植物遺傳資源學(xué)報(bào)，２００８，９（２）：１３８－１４３．

［５］ 李亞利，陳書霞，孟煥文，等．利用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化黃瓜的ＳＳＲ－ＰＣＲ反應(yīng)體系［Ｊ］．西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，２００８，１７（３）：２８０－２８４．

［６］ 朱世楊，羅天寬，張小玲，等．水稻ＳＳＲ－ＰＣＲ反應(yīng)體系的優(yōu)化［Ｊ］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，２００９，３７（８）：３４４１－３４４３，３４４７．

［７］ 史公軍，侯喜林．不結(jié)球白菜ＲＡＰＤ反應(yīng)體系的優(yōu)化［Ｊ］．江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，２００４，２６（１）：１－５．

［８］ 王彥華，侯喜林，徐明宇．正交設(shè)計(jì)優(yōu)化不結(jié)球白菜ＩＳＳＲ反應(yīng)體系研究［Ｊ］．西北植物學(xué)報(bào)，２００４，２４（５）：８９９－９０２．

［９］ 楊琦，張魯剛．大白菜ＳＲＡＰ反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化［Ｊ］．西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，２００７，１６（３）：１１９－１２３．

［１０］ 徐瑩瑩，屈淑平，崔崇士．大白菜ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反應(yīng)體系的優(yōu)化［Ｊ］．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，２００８，３９（８）：３１－３４．

［１１］ 石磊，李麗，鄭曉鷹．大白菜ＳＳＲ檢測體系的優(yōu)化［Ｊ］．分子植物育種，２００７，５（１）：１１０－１１６．

［１２］ 曹家樹，曹壽椿，易清明．白菜及其相鄰類群基因組ＤＮＡ的ＲＡＰＤ分析［Ｊ］．園藝學(xué)報(bào)，１９９５，２２（１）：４７－５２．

［１３］ ＤＩＥＴＥＲＩＣＨ Ｊ Ｈ， ＢＲＡＵＮ Ｈ Ｐ， ＳＣＨＭＩＴＺ Ｕ Ｋ． Ａｌｌｏｐｌａｓｍｉｃ ｍａｌｅ ｓｔｅｒｉｌｅ ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（ＣＭＳ Ｔｏｕｒｎｅｆｏｒｔｉｉ－Ｓｔｉｅｗｅ） ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｓｐｅｃｉａｌ ｇｅｎｅ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ａｒｏｕｄ ａ ｎｏｖｅｌ ａｔｐ９ ｇｅｎｅ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍ，２００３，２６９（６）：７２３－７３１．

［１４］ 謝文剛，張新全，彭燕，等．鴨茅ＳＳＲ－ＰＣＲ反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選［Ｊ］．分子植物育種，２００８，６（２）：３８１－３８６．

［１５］ 王乃坤，江樹華，曲志程．正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法在試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的應(yīng)用［Ｊ］．黑龍江交通科技，２００３（８）：８９－９０．