穆拉提·阿不都米吉提 石長(zhǎng)青 吳建勇 朱廣藝 王廷龍 胡建軍*

（1塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300）（2新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊830000）

副結(jié)核?。≒aratuberculosis）是由禽分枝桿菌副結(jié)核亞種（Mycobactrium avium subsp.paratuberculosis，MAP）引起的一種慢性傳染病。犢牛感染后通常會(huì)有2～5年的亞臨床感染期，期間動(dòng)物機(jī)體日漸消瘦，體重下降、營(yíng)養(yǎng)不良，發(fā)生低蛋白血癥，導(dǎo)致感染牛跛行、乳房炎、消化道和呼吸道疾病發(fā)病率高出1～5倍［1,2]。感染牛作為傳染源，間歇性向外通過糞便排菌，增加其他牛暴露風(fēng)險(xiǎn)。因此定期檢測(cè)、早期發(fā)現(xiàn)牛副結(jié)核對(duì)規(guī)?；?chǎng)的防控、凈化具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品的處理

1.1.1 血樣的采集與處理

以“95%的置信區(qū)間，50%最大預(yù)計(jì)流行率”為原則的抽樣策略，采集新疆南疆某牛場(chǎng)2年齡以上泌乳牛血清樣品80份，-20℃保存用于副結(jié)核分枝桿菌血清抗體ELISA檢測(cè)。

1.1.2 糞樣的采集與處理

根據(jù)牛副結(jié)核血清抗體ELISA檢測(cè)結(jié)果，采集陽(yáng)性牛直腸糞便樣品，放置-20℃保存用于副結(jié)核分枝桿菌的病原學(xué)檢測(cè)。

1.2 主要試劑

副結(jié)核分枝桿菌抗體檢測(cè)試劑盒（Mycobacterium paratuberculosis Antibody Test Kit），購(gòu) 自 愛 德 士（IDEXX）北京元亨生物科技有限公司（貨號(hào)：P07130-10，批號(hào)：8070）?？顾崛旧玖嫌伤锬拘竽量萍贾攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室所提供。副結(jié)核分枝桿菌（ATCCBAA-968）的陽(yáng)性質(zhì)粒由新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所提供。DNA凝膠回收試劑盒、QIAamp?DNA Stool Mini Kit、2×Taq PCR MasterMix、D2000 Marker均購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司。擴(kuò)增所用副結(jié)核分枝桿菌IS900引物序列鑒定引物序列參考Moss等［3]。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 副結(jié)核分枝桿菌IS900分子鑒定引物序列

亞型擴(kuò)增所用副結(jié)核分枝桿菌DMC529、DMC531、DMC533引物序列其參考Collins等［4]。

表2 副結(jié)核分枝桿菌DMC亞型分子鑒定引物序列

1.3 儀器

多功能全波長(zhǎng)96孔酶標(biāo)儀（Synergy H1/美國(guó)BioTek公司）。PCR儀（TC-5000，英國(guó)TECHNE公司），小型高速冷凍離心機(jī)（Centrifuge 5415R，Eppendorf公司），電泳儀（Thermal cycler Block，Thermo Fisher公司），凝集成像儀（Gel DocTM XR+，Bio-RAD公司）。

1.4 副結(jié)核分支桿菌參考菌株序列

本研究中涉及的細(xì)菌參考株序列均下載于NCBI中GenBank，見表3。

表3 參考菌株

續(xù)上表

1.5 方法

1.5.1 牛副結(jié)核分枝桿菌血清抗體ELISA檢測(cè)

按照副結(jié)核分枝桿菌抗體ELISA檢測(cè)試劑盒（愛德士北京元亨生物科技有限公司）操作說明書，對(duì)采集的80份奶牛血清樣品進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.2 抗酸性染色

稱取副結(jié)核分枝桿菌血清抗體ELISA檢測(cè)陽(yáng)性牛直腸糞便樣品200 g，加入0.5%NaOH溶液，在55℃條件下水浴30 min。四層紗布過濾，除去雜物，取濾液加入2 ml離心管，12 000 rpm/min速度離心5min。棄去上清，富集沉淀物，取少量沉淀物在玻片中心5 mm×2.5 mm范圍內(nèi)進(jìn)行涂片，用萋-尼抗酸染色法進(jìn)行染色鏡檢。

1.5.3 PCR鑒定

按照QIAamp?DNA Stool Mini Kit說明書，取富集沉淀物進(jìn)行DNA的提取。IS900基因PCR擴(kuò)增程序：95℃ 預(yù)變性5 min；95℃ 變性40 s、58℃ 退火40 s、72℃延伸70 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；亞型分型PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀中觀察目的片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收，測(cè)序，分析。

2 結(jié)果

2.1 牛副結(jié)核分枝桿菌血清抗體ELISA檢測(cè)結(jié)果

80份血清樣品經(jīng)牛副結(jié)核血清抗體ELISA檢測(cè)，其中4份為陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為5.0%（95%置信區(qū)間CI，1.38%～12.31%）。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，采集副結(jié)核分枝桿菌血清抗體ELISA檢測(cè)陽(yáng)性牛直腸糞便樣品，分別標(biāo)記8T、8U、8V、8W，如1.1.2所述處理。

2.2 抗酸染色結(jié)果

已采集的副結(jié)核分枝桿菌血清抗體ELISA檢測(cè)陽(yáng)性牛直腸糞便樣品，經(jīng)抗酸性染色鏡檢，可見背景及其它細(xì)胞為藍(lán)色，有呈紅色的短桿狀菌體。見圖1。

圖1 糞便樣品抗酸染色 10×100

2.3 IS900基因PCR鑒定結(jié)果

提取經(jīng)檢測(cè)為副結(jié)核分枝桿菌血清抗體ELISA檢測(cè)陽(yáng)性牛，8T、8U、8V、8W糞便樣品DNA，用副結(jié)核分枝桿菌IS900分子鑒定引物作PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得長(zhǎng)度約400 bp的預(yù)期擴(kuò)增片段，見圖2。

圖2 副結(jié)核分枝桿菌IS900基因PCR鑒定

2.4 DMC基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

采用副結(jié)核分枝桿菌亞型分型鑒定引物DMC529、DMC531、DMC533，對(duì)8T、8U、8V、8W 樣品作PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳，獲得長(zhǎng)度約310 bp大小的擴(kuò)增片段，見圖3。

圖3 副結(jié)核分枝桿菌DMC基因PCR鑒定

2.5 IS900與DMC基因核苷酸同源性比較及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

8T、8U、8V、8W 樣品經(jīng)測(cè)序，其序列相似性為100%。因此，本文只用8T樣品IS900基因序列（8TMAP-IS900）與DMC基因序列（Subtype-8T）作BLAST。發(fā)現(xiàn)8T-MAP-IS900基因序列與Gen Bank中AF305073.1、CP005928.1、CP015495.1、CP022095.2、CP022105.1、CP033909.1、FJ775181.1、FJ775182.1、JQ837281.1等副結(jié)核分支桿菌IS900序列同源性在99%以上；Subtype-8T基因序列與Gen Bank中CP015495.1、CP022095.2、CP022105.1、CP033909.1、CP010114.1、CP021238.1、CP033688.1等副結(jié)核分支桿菌DMC序列同源性在96.00%以上，序列基本信息如表3所示。

應(yīng)用DNAstar，8T-MAP-IS900序列與副結(jié)核分枝桿菌IS900參考序列進(jìn)行核苷酸同源性比較分析（見表4）。結(jié)果顯示，8T-MAP-IS900與JQ837281.1兩者同源性為100%，與FJ775181.1、FJ775182.1序列比對(duì)，同源性分別為99.5%，99.2%，與其他序列同源性均為99.7%。

表4 8T-MAP-IS900與副結(jié)核分枝桿菌參考菌株IS900序列同源性比較

根據(jù)副結(jié)核分枝桿菌IS900基因核苷酸序列同源性比較分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖4所示。8TMAP-IS900與JQ837281.1、AF305073.1、CP005928.1、CP015495.1、CP022095.2、CP022105.1、CP033909.1在遺傳進(jìn)化上具有高度親緣性。

應(yīng)用DNAstar，Subype-8T序列與副結(jié)核分枝桿菌DMC參考序列進(jìn)行核苷酸同源性比較分析（見表5）。 結(jié) 果 顯 示 ，Subtype-8T 與 CP010114.1、CP015495.1、CP022095.2、CP022105.1、CP033909.1等序列同源性均為99.4%。

圖4 副結(jié)核分枝桿菌IS900基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

表5 Subtype-8T與副結(jié)核分枝桿菌參考菌株DMC序列同源性比較

根據(jù)Subtype-8T副結(jié)核分枝桿菌DMC基因核苷酸序列同源性比較分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖5所 示 。 Subtype-8T 與 CP010114.1、CP015495.1、CP022095.2、CP022105.1、CP033909.1等序列在遺傳進(jìn)化上具有高度親緣性。

圖5 副結(jié)核分枝桿菌DMC基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

根據(jù)我國(guó)近年報(bào)道，從2012年至今已有3個(gè)直轄市，5個(gè)自治區(qū)，10個(gè)省份已報(bào)道檢出牛副結(jié)核病，其中包括山東（29.34%）［5]、內(nèi)蒙古（14.1%）［6]、安徽（8.0%）［7]、河南（5.63%）［8]、寧夏（4.29%）［9]等地區(qū)。孫雨等對(duì)2014-2015年對(duì)來自新疆的部分牛血清樣品進(jìn)行了血清學(xué)流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率為2.2%［10]，本試驗(yàn)以預(yù)計(jì)流行率的抽樣策略，共檢測(cè)80份2年齡以上泌乳牛血清樣品，檢出4份陽(yáng)性血清，該場(chǎng)牛副結(jié)核陽(yáng)性率為5.0%，與孫雨等報(bào)道相比高出近兩倍。牛副結(jié)核亞臨床期長(zhǎng)，不易引起獸醫(yī)與飼養(yǎng)人員的注意和關(guān)注，該病是長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)消耗的慢性傳染病，亞臨床期具有不定期排菌、不易表現(xiàn)臨床癥狀等特點(diǎn)，凈化較困難，在市場(chǎng)上目前針對(duì)該病尚無特效藥或有效疫苗，因此感染將會(huì)對(duì)奶牛場(chǎng)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)于副結(jié)核分枝桿菌，可快速獲得準(zhǔn)確的診斷或鑒定結(jié)果，由于副結(jié)核分枝桿菌存在遺傳異質(zhì)性，根據(jù)培養(yǎng)特性和致病力分為Ⅰ（羊）型，Ⅱ（牛）型及Ⅲ（生物中間）型。本試驗(yàn)測(cè)序獲得的8T-MAP-IS900序列與Subtype-8T序列基因比對(duì)結(jié)果，與 CP015495.1、CP022095.2、CP022105.1、CP033909.1等參考菌株的IS900序列同源性均為99.7%、DMC序列同源性為99.4%，從而確定該場(chǎng)存在Ⅱ型副結(jié)核分枝桿菌的感染。

吳建勇［11]在2016年報(bào)道新疆一些牛場(chǎng)地區(qū)存在Ⅱ（牛）型副結(jié)核分枝桿菌，2018年高建鵬［12]等所報(bào)道新疆北疆某規(guī)?；?chǎng)也存在Ⅱ（牛）型副結(jié)核分枝桿菌。Ⅱ（牛）型副結(jié)核分枝桿不僅感染牛也存在馬鹿感染的情況，王娜等報(bào)道，新疆地區(qū)馬鹿也有Ⅱ型副結(jié)核分枝桿菌感染的情況［13]。本試驗(yàn)通過血清學(xué)檢測(cè)，細(xì)菌學(xué)萋-尼氏抗酸染色鏡檢，PCR擴(kuò)增IS900基因及亞型基因鑒定并分析，證實(shí)在新疆南疆地區(qū)某牛場(chǎng)中存在Ⅱ（牛）型副結(jié)核分枝桿菌感染。根據(jù)本試驗(yàn)通過對(duì)新疆南疆某牛場(chǎng)牛副結(jié)核流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，目前新疆地區(qū)牛副結(jié)核存在感染的情況，為防止進(jìn)一步感染傳播，應(yīng)盡早引起關(guān)注。

牛副結(jié)核主要通過誤食帶菌污染糞便及飼草料而傳播，隔離是控制該病的有效措施之一。根據(jù)Malinee等［14]報(bào)道，嚴(yán)格進(jìn)行每年血清學(xué)檢測(cè)與隔離，減少犢牛與陽(yáng)性群的接觸，可有效防制該病。ELISA檢測(cè)技術(shù)具有高效、快速、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，敏感性、特異性高的優(yōu)點(diǎn)，能快速篩查牛群中是否存在牛副結(jié)核感染，但在檢測(cè)過程中需要特別注意的是2年齡前的育成?；蛘咛幱谠缙诟腥镜呐Ｒ壮霈F(xiàn)假陰性結(jié)果，因此，在檢測(cè)時(shí)要特別注意奶牛年齡的選擇以及檢測(cè)試劑盒的敏感性、特異性。

通過本試驗(yàn)對(duì)牛副結(jié)核病的病原鑒定及基因分型分析，為新疆南疆地區(qū)牛場(chǎng)牛副結(jié)核的病原學(xué)研究、流行病學(xué)調(diào)查提供了重要的參考數(shù)據(jù)，為開展牛副結(jié)核病防控、凈化提供了理論依據(jù)。