施 雅

(上海必諾檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司，上海 200436)

草銨膦(glufosinate)的化學(xué)名稱為：DL-甲基-(3-氨基-3-羧基丙基)膦酸銨,是拜耳公司研究開發(fā)的具有部分內(nèi)吸作用的非選擇性、觸殺性除草劑，是高效、低毒、大噸位使用的旱地除草劑[1]。作為除草劑，草銨膦幾乎能有效除去各種供試雜草，并且對(duì)農(nóng)作物安全，藥害小，是目前轉(zhuǎn)基因抗性作物理想的除草劑，應(yīng)用前景廣闊[2-4]。盡管草銨膦屬于非持久性農(nóng)藥，但大量和過(guò)量使用仍有可能在農(nóng)作物上農(nóng)藥殘留，從而對(duì)人類健康產(chǎn)生嚴(yán)重危害和影響[5-6]。目前包括歐盟、美國(guó)、日本、加拿大、中國(guó)等國(guó)均對(duì)草銨膦均提出了最大限量要求，限量范圍在0.02～8 mg/kg[7]。

草銨膦的檢測(cè)方法主要包括液相色譜法[8-9]、離子色譜法[10]、毛細(xì)管電泳法[11]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-13]等等。本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-MS/MS法，UPLC-MS/MS結(jié)合了色譜的分離技術(shù)的和質(zhì)譜的高選擇性，加入同位素內(nèi)標(biāo)消除基質(zhì)效應(yīng)，柱前衍生提高質(zhì)譜響應(yīng)值，實(shí)現(xiàn)了對(duì)于蘋果、哈密瓜、青菜、白菜四種果蔬中草銨膦殘留的快速檢測(cè)。該方法試劑成本低，結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，能夠滿足四中果蔬中草銨膦的檢測(cè)要求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

乙腈：色譜純，國(guó)藥集團(tuán)；甲酸、乙酸銨：優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)；FOMC-Cl、四硼酸鈉：分析純，美國(guó) Sigma公司；草銨膦標(biāo)準(zhǔn)品：純度﹥97.5%，購(gòu)自Dr.Ehrenstorfer公司；草銨膦-d3標(biāo)準(zhǔn)品：純度﹥99% ，加拿大TRC公司。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液濃度為1.0 mg/mL。 0～4℃冷藏避光保存。上述儲(chǔ)備液0.1 mL，用水定容至10 mL，溶液濃度為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

內(nèi)標(biāo)溶液配制：稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解，儲(chǔ)備液溶液濃度為100 μg/mL。0～4℃冷藏避光保存。去上述儲(chǔ)備液1 mL，用水定容至10 mL，溶液濃度為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

1.1.2 儀器設(shè)備

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀配有電噴霧離子源，美國(guó)安捷倫公司；勻漿機(jī)：JJ-2型，金壇市城西崢嶸實(shí)驗(yàn)儀器廠；高速冷凍離心機(jī)：Sorvall ST16R型，賽默飛世爾公司；渦旋震蕩器：Basic Vortex Mixer型，美國(guó)Talboys公司；氮吹儀：ANPEL DC12型，上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

提取：稱取5 g試樣(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入40 μL 10 μg/mL的d3-草銨膦同位素內(nèi)標(biāo)和10 mL水，震蕩提取30 s，用勻漿機(jī)在15000 r/min，勻漿提取1 min，于8000 r/min離心5 min，取上清液5 mL至8 mL，待凈化。

凈化：C18小柱經(jīng)5 mL甲醇和5 mL水活化后，將上述提取液正向通過(guò)C18小柱，棄去前2 mL洗脫液，收集后3 mL至5 mL流出液，待衍生。

衍生：取上述凈化后提取液600 μL，加入200 μL 1.0 mg/mL FMOC-Cl丙酮溶液和200 μL 30 g/L四硼酸鈉溶液，混勻，室溫下進(jìn)行衍生化反應(yīng)，放置過(guò)夜。過(guò)0.22 μm水相濾膜后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

標(biāo)準(zhǔn)液衍生：取適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液600 μL，加入200 μL 1.0 mg/mL FMOC-Cl丙酮溶液和200 μL 30 g/L四硼酸鈉溶液，混勻，室溫下進(jìn)行衍生化反應(yīng)，放置過(guò)夜，過(guò)0.22 μm水相濾膜后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.2.2 超高效液相色譜條件

色譜柱：Eslipse plus C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm粒徑)；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液(v/v)+乙腈(梯度洗脫見表1)；流速：0.4 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：3.0 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

1.2.3 串聯(lián)質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子模式；檢測(cè)方式：多反應(yīng)檢測(cè)；霧化器溫度：350℃霧化器流量：12 L/min；鞘氣溫度：400℃；鞘氣流量：12 L/min；定性、定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的碎裂電壓和碰撞能量見表2。

表2 草銨膦的質(zhì)譜參數(shù)

注：a 定量離子。對(duì)于不同質(zhì)譜儀器，儀器參數(shù)可能存在差異，測(cè)定前應(yīng)將質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化到最佳。

2 結(jié)果討論

2.1 凈化方法的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)比較了C18固相萃取柱、MCX固相萃取柱、HLB對(duì)草銨膦回收率的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，C18固相萃取柱的凈化效果好。MCX、HLB在正相凈化過(guò)程中吸附了部分目標(biāo)化合物，導(dǎo)致了目標(biāo)化合物回收率的不穩(wěn)定和下降。C18填充物為非極性物質(zhì)，對(duì)于強(qiáng)極性草銨膦吸附性弱，并且能夠有效分離目標(biāo)化合物和雜質(zhì)，所以選擇C18固相萃取柱凈化樣品。

圖1 固相萃取柱對(duì)凈化效果的影響

2.2 分析方法線性范圍考察

分別選取蘋果、哈密瓜、青菜和白菜四種樣品，按照前處理方法，采用所得到的基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度分別為0 ng/mL、10～500.0 ng/mL，再經(jīng)過(guò)衍生，經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中被測(cè)組分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，以被測(cè)組分濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在四種基質(zhì)中草銨膦相應(yīng)的回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表3。

表3 草銨膦在四種果蔬基質(zhì)加標(biāo)的回歸方程和相關(guān)系數(shù)

由表3可知，在0～500 ng/mL范圍內(nèi)草銨膦濃度與其色譜峰面積響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系。草銨膦標(biāo)準(zhǔn)溶液的多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖見圖2。由圖2表明，10 ng/mL的草銨膦響應(yīng)值良好。

圖2 草銨膦標(biāo)準(zhǔn)品的MRM色譜圖

Fig.2 MRM chromatogram of glufosinate standards

2.3 準(zhǔn)確度和精密度

按本方法確定的條件，選擇蘋果、哈密瓜、青菜、白菜四種果蔬作為基質(zhì)樣品，進(jìn)行50、100、500 μg/kg三個(gè)水平的添加回收試驗(yàn)，各水平進(jìn)行6次平行測(cè)定，回收率和精密度見表4。

表4 草銨膦在不同果蔬中加標(biāo)回收率及精密度測(cè)定結(jié)果

由表4可知，在這四種果蔬中添加不同含量的草銨膦，其平均回收率達(dá)到85.5%～97.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，表明該方法對(duì)不同樣品和不同含量的草銨膦的測(cè)定均具有很好的準(zhǔn)確度和精密度。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定四種果蔬中草銨膦的檢測(cè)方法。草銨膦屬于強(qiáng)極性化合物，采用純凈水提取，經(jīng)過(guò)C18固相萃取柱凈化，消除了色素、脂類物質(zhì)的干擾，經(jīng)過(guò)衍生后，再應(yīng)用Agilent Eclipse plus C18色譜柱分離，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，電噴霧串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量，實(shí)現(xiàn)了對(duì)草銨膦定性、定量測(cè)定。該檢測(cè)方法成本低廉、方法簡(jiǎn)單、快速、定性定轉(zhuǎn)準(zhǔn)確，能夠滿足四中果蔬中草銨膦殘留的檢測(cè)。