張彩霞，董相軍

(青島職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山東 青島 266555)

霞草(Gypsophila oldhamiana Miq.)，又名長(zhǎng)蕊石頭花、山菜(山東)等，在山東、陜西、河南等多省山地的陽(yáng)坡、半陽(yáng)坡[1]廣泛生長(zhǎng)，山東莒南已人工栽培成功[2]。經(jīng)研究，霞草根中含有黃酮、皂苷等多種化學(xué)成分[3]，其制品山銀柴胡可入藥[4]。微波輔助提取霞草根中黃酮類化合物的工藝研究尚未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)，本文利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)霞草根中總黃酮微波輔助提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并根據(jù)最優(yōu)工藝條件，對(duì)不同生長(zhǎng)期霞草根中的總黃酮含量進(jìn)行了檢測(cè)分析，為霞草的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 試藥

霞草根(在不同生長(zhǎng)期采集于青島市黃島區(qū)小珠山，自然陰干，粉碎過(guò)篩)；蘆丁對(duì)照品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所)，亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉和無(wú)水乙醇均為分析純。

1.2 儀器與試劑

WP700型LG微波爐(天津樂(lè)金電子電器有限公司)；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)； UV1801型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮的含量測(cè)定

2.1.1 制備標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

蘆丁對(duì)照品干燥至恒重，精密稱取23.0 mg，用70%乙醇溶解、定容至100 mL。

2.1.2 選取檢測(cè)波長(zhǎng)

在400～700 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描蘆丁適宜濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)蘆丁的吸收曲線確定蘆丁最大吸收波長(zhǎng)510 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.3 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

取5個(gè)25 mL容量瓶，分別加入標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0加去離子水6 mL，加1.0 mL亞硝酸鈉溶液(5%)，搖勻靜置6 min， 加1.0 mL硝酸鋁溶液(10%)，搖勻靜置6 min，加10.0 mL氫氧化鈉溶液(4%)，用去離子水定容，搖勻靜置15 min，在510 nm 處測(cè)定吸光度。

以不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度(A)為縱坐標(biāo)、濃度(C)為橫坐標(biāo)，繪制吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸光度與濃度的回歸方程為A=10.755C-0.0078(r=0.9997)。結(jié)果表明，蘆丁濃度在0.0082～0.0410 mg/mLl范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 微波功率對(duì)黃酮提取的影響

選取微波爐溫火、解凍和低火三檔、乙醇濃度80%、液料比40∶1、時(shí)間60 s為試驗(yàn)條件測(cè)試總黃酮的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溫火檢測(cè)含量為3.78 mg/g,解凍檢測(cè)含量為4.36 mg/g,低火檢測(cè)含量為3.73 mg/g?？梢?jiàn)隨著微波火力的增加，霞草根總黃酮檢測(cè)含量先上升再下降，微波火力為解凍時(shí)，總黃酮檢測(cè)含量最高。考慮可能是溫度太高，影響部分黃酮類化合物的穩(wěn)定性，同時(shí)造成提取液乙醇揮發(fā)加快，降低了乙醇的濃度。

2.2.2 微波時(shí)間對(duì)總黃酮提取的影響

圖1 微波時(shí)間對(duì)霞草根總黃酮提取含量的影響

選微波爐解凍檔，提取時(shí)間分別為20、40、60、80、100和120 s，液料比為40∶1，乙醇濃度分別為80%，檢測(cè)總黃酮的含量。結(jié)果表明(見(jiàn)圖1)，隨著微波處理時(shí)間的延長(zhǎng)，霞草根總黃酮檢測(cè)含量先提高再逐漸下降，微波處理時(shí)間為40 s時(shí)達(dá)到最高。

2.2.3 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取的影響

選微波爐解凍檔，時(shí)間40 s，液料比為40∶1，乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，檢測(cè)總黃酮含量。結(jié)果表明(見(jiàn)圖2)，乙醇濃度梯度的變化對(duì)總黃酮的提取效果影響較顯著，乙醇濃度低總黃酮提取不完全，乙醇濃度太大提取液中雜質(zhì)較多，并且影響檢測(cè)的顯色反應(yīng)，80%乙醇提取效果最好。

圖2 乙醇濃度對(duì)霞草根總黃酮提取含量的影響

2.2.4 液料比對(duì)總黃酮提取的影響

選微波爐解凍檔，時(shí)間40 s，液料比分別為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1和60∶1，乙醇濃度分別為80%。由圖3可知,隨著液料比的增加,霞草根總黃酮提取含量逐漸增加,當(dāng)料液比為40∶1以后，提取含量變化趨緩。液料比40∶1以后增加液料比對(duì)提取效果影響較小而乙醇使用及回收成本增加，故液料比以40∶1較好。

圖3 液料比對(duì)霞草根總黃酮提取含量的影響

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，進(jìn)一步分析各因素對(duì)提取效果影響，以確定最佳微波提取條件，以乙醇濃度(A)、微波功率(B)、提取時(shí)間(C)和料液比(D)4個(gè)因素3個(gè)水平(見(jiàn)表1)，用L9(3)4正交表進(jìn)行試驗(yàn)。

表1 正交試驗(yàn)水平與因素表

試驗(yàn)結(jié)果表明(見(jiàn)表2)，乙醇濃度(A)、微波功率(B)、提取時(shí)間(C)和料液比(D)對(duì)總黃酮提取效果的影響大小順序?yàn)锳>D>B>C，選擇最優(yōu)條件為A3B2C2D3。由于A3B2C2D3組合并未出現(xiàn)在正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)中，因此需要對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)。以A3B2C2D3工藝條件提取檢測(cè)霞草根總黃酮的含量，檢測(cè)含量為4.610 mg/g ，高于正交試驗(yàn)中A3B3C1D2組合，結(jié)果表明正交試驗(yàn)結(jié)果是可靠的。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4 提取次數(shù)的選取

以A3B2C2D3工藝條件提取確定總黃酮的提取次數(shù)，分別提取1次、2次、3次，總黃酮的提取率分別為75.3%、93.7%、99.1%?？梢?jiàn)，提取兩次后只有約6%的總黃酮?dú)埩粼诹显?。綜合考慮能源的利用，確定總黃酮的最佳提取次數(shù)為2次。

2.5 總黃酮含量的動(dòng)態(tài)變化

選取營(yíng)養(yǎng)期(6月)、花期(8月)、果期(10月)和休眠期(2月)的霞草根，根據(jù)最佳微波工藝A3B2C2D3提取2次，對(duì)不同生長(zhǎng)期的霞草根中總黃酮的含量進(jìn)行測(cè)定。營(yíng)養(yǎng)期總黃酮含量為(6.56 mg/g)，休眠期總黃酮含量為 (6.21 mg/g)，花期總黃酮含量為(4.63 mg/g)，果期總黃酮含量為(3.94 mg/g)?？梢钥闯?，營(yíng)養(yǎng)期霞草根總黃酮的含量最高，次之的為休眠期，果期含量最低。

3 結(jié)論

微波法作為輔助提取霞草中總黃酮的一種方法，可以有效提高提總黃酮的提取效果，縮短提取時(shí)間。最佳提取方案為：乙醇濃度80%，液料比40∶1(mL/g)，微波提取時(shí)間40 s，微波功率(解凍)。霞草根中黃酮類化合物的含量在不同的生長(zhǎng)期變化較大，總黃酮含量從高到低依次為營(yíng)養(yǎng)期、休眠期、花期、果期。