賈瑋 張榮 石琳 張峰 許秀麗 儲(chǔ)曉剛

摘?要?采用數(shù)據(jù)依賴型采集質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)585種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的化合物分子離子質(zhì)荷比、二級(jí)碎裂片段的質(zhì)荷比與保留時(shí)間等進(jìn)行研究，建立了農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)，并對(duì)8類100種農(nóng)藥進(jìn)行片段斷裂機(jī)理研究，得到不同類別農(nóng)藥的特征斷裂片段。將特征斷裂片段與農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)相結(jié)合，基于數(shù)據(jù)非依賴采集質(zhì)譜技術(shù)，構(gòu)建非定向篩查方法，方法檢出限和檢測(cè)容量分別為0.001～539 μg/kg與0.001～899 μg/kg，回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為77%～113%和0.1%～8.3%。將所建立方法用于市售93個(gè)批次巴氏殺菌乳與超高溫瞬時(shí)滅菌乳中農(nóng)藥的非定向分析，發(fā)現(xiàn)樣品中含有前期未檢出的嘧菌酯與草克樂(lè)，含量分別為2.3和6.1 μg/kg。建立的非定向篩查分析方法可為快速篩查鑒定乳制品中農(nóng)藥提供有效的技術(shù)手段。

關(guān)鍵詞?非定向篩查; 超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜; 乳及乳制品; 農(nóng)藥殘留

1?引 言

因上游規(guī)?；B(yǎng)殖加速、人口結(jié)構(gòu)變化、消費(fèi)結(jié)構(gòu)升級(jí)等原因，乳制品消費(fèi)量持續(xù)增長(zhǎng)，其質(zhì)量與安全問(wèn)題也更受關(guān)注[1，2]，而農(nóng)藥殘留是影響乳制品質(zhì)量的重要因素[3]。非定向技術(shù)篩查食品中相關(guān)化學(xué)危害物是我國(guó)“十三五”規(guī)劃中前沿技術(shù)之一[4]，旨在鑒定樣品中未知化合物，在海量的數(shù)據(jù)中進(jìn)行篩選與確證，同時(shí)運(yùn)用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理[5]。非定向篩查是基于高分辨質(zhì)譜的數(shù)據(jù)非依賴采集（Data independent acquistition，DIA）模式，在一級(jí)掃描中均勻地采集質(zhì)荷比范圍內(nèi)每個(gè)窗口的待分析物信息，具有較高的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性[6～8]。但因其信息采集窗口較大，進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜的片段較多，產(chǎn)生復(fù)雜的碎片離子，不利于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析[9]。開(kāi)發(fā)可變的數(shù)據(jù)非依賴采集（Varible data independent acquistition， vDIA）方法，可根據(jù)目標(biāo)物質(zhì)所分布的質(zhì)荷比范圍，動(dòng)態(tài)調(diào)整各個(gè)窗口的大小，以提高選擇性與掃描速度[10，11]。

乳制品產(chǎn)業(yè)鏈長(zhǎng)，在飼料種植過(guò)程中大量使用除草劑、殺蟲(chóng)劑、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等農(nóng)藥，以提高產(chǎn)量[12～15]，農(nóng)藥通過(guò)食物鏈與生物富集作用進(jìn)入生乳中[16，17]。在后續(xù)熱加工中，農(nóng)藥及其殘留率會(huì)有所變化[18，19]。傳統(tǒng)的全掃描數(shù)據(jù)依賴篩查（Full MS/dd-MS2）依據(jù)MS/MS片段，只允許在目標(biāo)清單范圍內(nèi)識(shí)別農(nóng)藥殘留[20～22]，所以有必要采用非定向技術(shù)篩查乳制品的農(nóng)藥及其殘留產(chǎn)物，且目前大多數(shù)農(nóng)藥特征斷裂片段在m/z 200～500的范圍內(nèi)，因此，調(diào)整此范圍窗口的大小，可提高方法的選擇性。

本研究利用超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道離子阱質(zhì)譜（UHPLC-Q-Orbitrap MS）技術(shù)， 在Full MS/dd-MS2掃描模式下建立農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)，同時(shí)將已知農(nóng)藥特征斷裂片段應(yīng)用于乳制品非定向農(nóng)藥篩查技術(shù)中，使用Full MS/vDIA掃描模式對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行非定向篩查（實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖1），實(shí)現(xiàn)了乳及乳制品中的農(nóng)藥殘留的快速、高通量、非定向篩查。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

Avnti J-26×PI型高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter公司）; Vortex.Genie2T型旋渦混合器（美國(guó)Scientific Industries公司）; SA31型振蕩器（日本Yamata公司）; 超聲波清洗器（江蘇昆山超聲儀器有限公司）; AL204-IC型分析天平、SevenEasy S20K型pH計(jì)（瑞士Mettler Toledo公司）; ED-115型恒溫干燥箱（德國(guó)Binder公司）; UltiMate3000-Q-Exactiv超高效液相色譜-四極桿靜電場(chǎng)軌道離子阱質(zhì)譜、Accucore C-18 aQ色譜柱預(yù)柱、Hypersil Gold aQ C-18色譜柱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）; Milli-Q Integral型純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

NaCl（色譜純，荷蘭Akzo Nobel公司）; 0.20 μm微孔濾膜（美國(guó)Pall公司）; 石墨化炭黑GCB吸附劑（粒徑40～120 μm）、C18和PSA吸附劑（粒徑40～60 μm，平均孔徑60 ）、陶瓷均質(zhì)石（美國(guó)Agilent Technologies公司）; 無(wú)水乙酸鈉、倍半水合檸檬酸二鈉、二水合檸檬酸鈉（優(yōu)級(jí)純，美國(guó)Supelco公司）; 甲苯、乙酸銨（色譜純，美國(guó)Supelco公司）; 丙酮、乙腈（色譜純，美國(guó)Fisher科技公司）; 甲醇、甲酸、乙酸、甲酸銨（色譜純，美國(guó)Sigma公司）; 585種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司、英國(guó)LGC Standards公司、瑞士Fluka公司、德國(guó)Sigma-Aldrich公司與德國(guó)Witega公司）。巴氏殺菌乳與超高溫瞬時(shí)滅菌乳樣品購(gòu)自本地超市。

2.2?實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1?溶液的配制?分別稱取農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0.1 mg），依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在不同溶劑（甲醇、乙腈和甲苯）中溶解度與測(cè)定需要，選用合適的溶劑溶解并定容至10 mL，配制成1000 μg/L的單一化合物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于20℃避光保存。移取適量單一化合物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇-水溶液（1∶1， V/V）稀釋并定容至100 mL棕色容量瓶，配制相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合工作溶液，于20℃避光保存。

基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用于標(biāo)準(zhǔn)校正曲線的繪制，乳及乳制品經(jīng)2.2.2節(jié)樣品前處理后獲取空白樣品提取液，移取5 mL空白樣品提取液共12份，氮吹至近干，分別加入1000 μg/L 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液10～5000 μL、甲醇5 mL，用8 mmol/L甲酸銨溶液配制成1～500 μg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.2?樣品前處理?稱取混勻乳制品樣品10 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入10 mL 1%（V/V）乙酸-乙腈（8∶4∶16，V/V）混合溶液，渦旋混合30 s后， 加入陶瓷均質(zhì)石、6.0 g無(wú)水MgSO4、1.45 g無(wú)水乙酸鈉，渦旋30 s后，振蕩提取1 min，在4 ℃以10000 r/min離心5 min，取200 μL濾液至2 mL進(jìn)樣小瓶中，加入500 μL 8 mmol/L甲酸銨溶液及300 μL甲醇，進(jìn)行UHPLC-Q-Orbitrap MS測(cè)定。

2.3?色譜質(zhì)譜條件

色譜柱： Accucore C-18 aQ預(yù)柱（10 mm×2.1 mm， 1.9 μm）， Hypersil Gold aQ C-18柱（100 mm×2.1 mm， ?1.9 μm）， 柱溫： 35℃。流動(dòng)相A為0.1%（V/V）甲酸-4 mmol/L甲酸銨溶液， 流動(dòng)相B為0.1%（V/V）甲酸-4 mmol/L甲酸銨-甲醇溶液。梯度洗脫程序： 0～1 min， 100% A; 1～7 min， 100%～0% A; 7～12 min， ?0% A; 12～13 min， 0%～100% A; 13～15 min， 100% A。流速為300 μL/min， 進(jìn)樣量5 μL， 碰撞氣為純氬氣（純度≥99.999%）。電噴霧離子化（ESI）離子源， 采用正模式， 鞘氣流速18 L/min， 鞘氣壓力275 kPa， 輔助氣流速3 L/min; 毛細(xì)管電壓： 3500 V。離子源溫度350℃， 毛細(xì)管溫度320℃。

全掃描模式下（Full Scan）， 分辨率設(shè)定為70000 FWHM， 自動(dòng)增益控制的目標(biāo)值（AGC）定為1.0×106， 容許的質(zhì)量誤差范圍為5 ppm， 最大注入時(shí)間250 ms， 動(dòng)態(tài)背景扣除（Dynamic Exclusion）設(shè)定為10.0 s。

第一種二級(jí)掃描方式Full MS/dd-MS2的分辨率設(shè)定為17500 FWHM， 自動(dòng)增益控制的目標(biāo)值定為5.0×105， 出峰后的觸發(fā)時(shí)間（Apex Trigger）為3～6 s， 最大注入時(shí)間120 ms， 動(dòng)態(tài)背景扣除為10.0 s， 選擇TOP 5模式。待碎裂的目標(biāo)分析物在特定的信息列表（Inclusion List）中設(shè)定， 容許質(zhì)量誤差范圍設(shè)定為10 ppm。當(dāng)待碎裂的離子響應(yīng)強(qiáng)度達(dá)到強(qiáng)度閾值8.3×104時(shí)， 即送入高能碰撞解離（HCD）碰撞池， 通過(guò)3個(gè)不同的碰撞能量（17.5、35.0和52.5 eV）分別進(jìn)行碰撞， 最終疊加得到一張子離子譜圖。

第二種二級(jí)掃描方式為可變的數(shù)據(jù)非依賴采集（vDIA），參數(shù)設(shè)定為： 掃描時(shí)間0～15 min; 自動(dòng)增益控制的目標(biāo)值設(shè)定為5.0×105，最大注入時(shí)間為120 ms; 分辨率采用17500 FWHM; 信息列表分為： 112.80116、137.81253、162.82390、187.83527、212.84663、237.85800、262.86937、287.88074、312.89211、337.90348、362.91485、387.92622、412.93758、437.94895、462.96032、487.97169、550.50011、650.54559、750.59106、850.63654，其中112.80116～487.97169設(shè)定為第一個(gè)vDIA掃描，隔離窗口范圍（Isolation window）設(shè)為25.0 Da，Loop Count設(shè)定為16（即16個(gè)掃描段），550.50011～850.63654設(shè)為第二個(gè)vDIA掃描，動(dòng)態(tài)背景扣除10.0 s，隔離窗口范圍設(shè)為100.0 Da，Loop Count設(shè)定為4。碰撞能量分別為17.5、35.0和52.5 eV。

3?結(jié)果與討論

3.1?農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)建立

按照2.2.1節(jié)的操作，將標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋配制成濃度為100 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)的采集，使得分子離子峰響應(yīng)強(qiáng)度大于5.0×106。運(yùn)用Full MS/dd-MS2掃描模式建立標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)，每個(gè)化合物平均進(jìn)樣6次，以確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性與重現(xiàn)性，信息包括分子離子質(zhì)荷比（理論值）、二級(jí)碎裂片段的質(zhì)荷比與保留時(shí)間。電子版文后支持信息表S1列出了585種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)部分內(nèi)容。數(shù)據(jù)庫(kù)的信息數(shù)據(jù)使用Exact Finder 2.5進(jìn)行管理。使用Mass Frontier 7.0軟件，基于電離模式與結(jié)構(gòu)式預(yù)測(cè)碎片斷裂結(jié)果，并結(jié)合dd-MS2實(shí)測(cè)的二級(jí)斷裂碎片的質(zhì)譜圖，選取1～3個(gè)響應(yīng)值高且特征性的碎裂片段; 根據(jù)元素的組成將碎裂片段質(zhì)荷比的實(shí)測(cè)值轉(zhuǎn)換為理論值，形成化合物標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)（Library）; 使用Library Manager 2.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)管理。電子版文后支持信息表S 2列出了585種農(nóng)藥的高效液相色譜/四極桿-軌道離子阱質(zhì)譜參數(shù)。

3.2?片段斷裂特征及其在農(nóng)藥殘留篩查中的作用

3.2.1?農(nóng)藥質(zhì)譜裂解反應(yīng)機(jī)理?實(shí)驗(yàn)中對(duì)100種農(nóng)藥進(jìn)行了片段斷裂機(jī)理研究，得到了所有片段的質(zhì)譜裂解反應(yīng)途徑。以有機(jī)氯類農(nóng)藥芐草?。–umyluron）為例進(jìn)行分析，芐草隆dd-MS2掃描譜圖如圖2所示。芐草隆的分子離子質(zhì)荷比（m/z）理論值為303.12587，經(jīng)加氫后，在奇電子離子中有一個(gè)未成對(duì)電子，此電子在分子離子中處于反應(yīng)的最有利位置，形成游離基中心，由圖3可見(jiàn)，游離基中心定義于飽和N原子（亞氨基）上，未成對(duì)電子有趨于成對(duì)傾向，形成α斷裂反應(yīng)的推動(dòng)力，誘導(dǎo)與亞氨基相鄰的芐基外側(cè)鏈斷裂，形成m/z 185.04762與119.08553兩個(gè)碎裂片段，m/z 185.04762碎裂片段進(jìn)行γ位氫原子重排反應(yīng)（rHC），在N游離中心誘導(dǎo)下，使γ氫原子重排到與N連接的位置，接著發(fā)生斷裂形成m/z 73.03964碎裂片段。m/z 119.08553碎裂片段還有兩種來(lái)源途徑： 一種來(lái)源途徑是電荷中心誘導(dǎo)斷裂（i斷裂），正電荷中心位于酰脲結(jié)構(gòu)的O原子上，與酰脲結(jié)構(gòu)相連芐基的鍵上一對(duì)電子被正電荷中心所吸引，造成電荷的轉(zhuǎn)移和兩側(cè)芐基單鍵的斷裂，形成m/z 119.08553與125.01525兩個(gè)碎裂片段; 另一種來(lái)源途徑為遠(yuǎn)端重排反應(yīng)（rHR），芐基與酰脲結(jié)構(gòu)相連的氫由于處在支化程度最高的碳原子上，極不穩(wěn)定，在游離基誘導(dǎo)的氫重排反應(yīng)中，該氫與芐基內(nèi)部不成對(duì)電子位置發(fā)生互換，因此支化程度最高的碳原子上接受原處于苯環(huán)上的不成對(duì)電子，芐基與酰脲結(jié)構(gòu)斷裂[23]。

3.2.2?片段斷裂特征?芐草隆的分子式為C17H19ClN2O， 屬于有機(jī)氯農(nóng)藥，有機(jī)氯農(nóng)藥主要依據(jù)合成原料結(jié)構(gòu)特征分為苯、環(huán)戊二烯、莰烯和萜烯四大類。因氯苯結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，動(dòng)物與植物體內(nèi)不含有相應(yīng)的降解酶，通過(guò)食物鏈產(chǎn)生生物富集作用，毒性顯著，含氯苯結(jié)構(gòu)的有機(jī)氯農(nóng)藥被廣泛使用[24]。通過(guò)對(duì)氯苯結(jié)構(gòu)的有機(jī)氯農(nóng)藥片段斷裂機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，芐草隆、克死螨、3-氯對(duì)甲苯胺、綠麥隆、庚烯磷、多效唑與滅菌唑等氯苯結(jié)構(gòu)農(nóng)藥均有C7H6Cl+碎片（m/z 125.01524）， 即功效作用（結(jié)構(gòu)特性）與片段斷裂特征一致。離子裂解的基本機(jī)理本質(zhì)為電子轉(zhuǎn)移規(guī)律，包括游離基中心誘導(dǎo)的鍵斷裂、電荷中心誘導(dǎo)的鍵斷裂、簡(jiǎn)單鍵斷裂（σ斷裂）和重排反應(yīng)四大基本裂解反應(yīng)類型，所以離子裂解的歷程具有規(guī)律性[25]。因化合物斷裂為分子離子，與高純氮?dú)馀鲎玻瑒?dòng)能轉(zhuǎn)化為熱能，化學(xué)結(jié)合鍵斷裂，故采用了高（52.5 eV）、中（35.0 eV）、低（17.5 eV）3個(gè)碰撞能，得到的二級(jí)譜圖為3個(gè)碰撞能譜圖的均一化結(jié)果，碎裂片段信息豐富，規(guī)律的碰撞誘導(dǎo)歷程（特征斷裂片段信息）在已建立的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)中均得到全面體現(xiàn)。通過(guò)對(duì)片段斷裂機(jī)理研究，并結(jié)合不同化合物的功效作用，表1列出了有機(jī)氯類、有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類、擬除蟲(chóng)菊酯類等100種農(nóng)藥的特征斷裂片段。

根據(jù)結(jié)構(gòu)特性，農(nóng)藥分為有機(jī)氯類、有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類、擬除蟲(chóng)菊酯類、三唑類、三嗪類、煙堿類與酰胺類。有機(jī)磷類農(nóng)藥的功能基團(tuán)為磷酰基，磷?；c乙酰膽堿酶活性位點(diǎn)緊密結(jié)合，形成磷酰化膽堿酯酶，乙酰膽堿酶活性被抑制，以致乙酰膽堿不能及時(shí)分解，在體內(nèi)大量蓄積，突觸后膜上受體不斷與乙酰膽堿結(jié)合，造成突觸后膜上Na+通道處于開(kāi)放狀態(tài)，Na+涌入膜內(nèi)使膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)度興奮，最后導(dǎo)致衰竭[26]。磷?；|(zhì)譜碎片為C2H6O2PS+（m/z 124.98206）、C2H7NO2P+（m/z 108.02089）、H4O4P+（m/z 98.98417）、CH4OPS+（m/z 94.97150）。氨基甲酸酯類農(nóng)藥為氨基甲酸的N-甲基取代酯類，氨基甲酸的N-甲基取代酯類可將膽堿酯酶活性中心的羥基甲?；?，并形成疏松的復(fù)合體，抑制乙酰膽堿水解能力，造成組織內(nèi)乙酰膽堿蓄積，引起遲發(fā)型神經(jīng)疾病[27]。氨基甲酸N-甲基取代酯結(jié)構(gòu)質(zhì)譜碎片為C2H3NO+（m/z 55.02092）。擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥的功能基團(tuán)為除蟲(chóng)菊素結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)可直接作用于神經(jīng)膜的Na+通道，干擾Na+的傳導(dǎo)，使跨膜離子流延長(zhǎng)，造成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)軸與感覺(jué)神經(jīng)纖維反復(fù)活動(dòng)，最終運(yùn)動(dòng)失調(diào)[28]，除蟲(chóng)菊素結(jié)構(gòu)質(zhì)譜碎片為C9H15+（m/z 123.11683）。三唑類農(nóng)藥活性基團(tuán)為三唑結(jié)構(gòu)，三唑結(jié)構(gòu)通過(guò)抑制生物體合成麥角甾醇，加劇細(xì)胞膜滲透，導(dǎo)致細(xì)胞膜功能被破壞[29]。三唑結(jié)構(gòu)質(zhì)譜碎片為C2H4N3+（m/z 70.03997）。三嗪類農(nóng)藥功能基團(tuán)為三嗪結(jié)構(gòu)，三嗪結(jié)構(gòu)通過(guò)抑制生物幾丁質(zhì)合成，擾亂前胸腺體與心側(cè)體等神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)正?；顒?dòng)[30]，三嗪結(jié)構(gòu)質(zhì)譜碎片為C4H9N2+（m/z 85.06702）。煙堿類農(nóng)藥的活性基團(tuán)為煙堿結(jié)構(gòu)，煙堿結(jié)構(gòu)可與煙堿型的乙酰膽堿結(jié)合，刺激神經(jīng)系統(tǒng)，機(jī)體興奮、痙攣、麻痹而死[31]，煙堿結(jié)構(gòu)質(zhì)譜碎片為C7H8N+（m/z 85.06702）。酰胺類農(nóng)藥的功能基團(tuán)為酰胺結(jié)構(gòu)，酰胺結(jié)構(gòu)與鈣離子通道中魚(yú)尼丁受體結(jié)合，抑制Ca2+通道活性，導(dǎo)致生物體失去肌肉收縮舒張功能[32]，酰胺結(jié)構(gòu)質(zhì)譜碎片為C8H5NO+2（m/z 148.03930）。

3.2.3?特征斷裂片段在外源性風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)篩查中的應(yīng)用?將農(nóng)藥特征斷裂片段與農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)相結(jié)合應(yīng)用于乳制品非定向農(nóng)藥篩查中。采用Full MS/vDIA掃描模式，運(yùn)用表1中農(nóng)藥特征斷裂片段對(duì)色譜圖進(jìn)行峰提取，若捕獲到未出現(xiàn)在農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)信息譜庫(kù)且呈高斯分布的色譜峰，

即可初步判斷該物質(zhì)的農(nóng)藥歸屬類別，繼而對(duì)該保留時(shí)間色譜峰的其它片段信息進(jìn)行分析，包括m/z、碎裂片段豐度比與同位素豐度比，從而推斷出該物質(zhì)和元素組成，將該物質(zhì)推斷的片段斷裂途徑與已建立的該類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)信息譜庫(kù)中歸屬類的其它化合物斷裂途徑比對(duì)，判斷該化合物的分子式與結(jié)構(gòu)式，通過(guò)分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的色譜質(zhì)譜信息進(jìn)行最終判定?；衔餄舛扔扇橹破分修r(nóng)藥化合物與化合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積比再乘以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度計(jì)算而得。例如，在篩查一個(gè)牛乳樣品時(shí)，運(yùn)用有農(nóng)藥特征斷裂片段m/z 125.01524提取出呈高斯分布且在標(biāo)準(zhǔn)信息庫(kù)中沒(méi)有的色譜峰，如圖4所示，碎裂片段為氯苯結(jié)構(gòu)，初步判斷該物質(zhì)為有機(jī)氯農(nóng)藥，通過(guò)m/z、同位素豐度比、片段豐度比信息推斷該物質(zhì)分子式為CxHyClzNS，將豐度較高的片段的碎裂途徑與農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)信息譜庫(kù)的其它化合物斷裂途徑對(duì)比，發(fā)現(xiàn)該未知化合物與芐草隆的碎裂片段斷裂機(jī)理相似（圖5），通過(guò)對(duì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比對(duì)分析，判斷該化合物為草克樂(lè)，且定量結(jié)果為6.1 μg/kg。

3.3?方法學(xué)參數(shù)考察

方法學(xué)參數(shù)考察根據(jù)歐盟標(biāo)準(zhǔn)2002/657/EC與SANCO/12571/2015。按以下公式計(jì)算檢測(cè)方法的基質(zhì)效應(yīng)（C，%）：

其中，C（%）為基質(zhì)效應(yīng); Ss為目標(biāo)化合物運(yùn)用純?nèi)軇┲谱鳂?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率; Sm為目標(biāo)化合物加入空白基質(zhì)制作的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

結(jié)果表明，在585種農(nóng)藥中，大部分化合物存在基質(zhì)效應(yīng)，其中11.6%屬于中等強(qiáng)度的基質(zhì)效應(yīng)（20%～50%），85.9%為較弱基質(zhì)效應(yīng)（±20%以內(nèi)），其余的少數(shù)化合物屬于強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)（50%～100%）。為盡量降低基質(zhì)效應(yīng)干擾，在建立校準(zhǔn)曲線時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合溶液采用基質(zhì)匹配法進(jìn)行配制。配制585種農(nóng)藥系列混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液，濃度為0.1～500 μg/kg。檢測(cè)方法中外源性風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)在各自相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.99，呈良好的線性關(guān)系。

在進(jìn)行非定向篩查時(shí)，根據(jù)歐盟分析方法性能標(biāo)準(zhǔn)、定性定量檢測(cè)技術(shù)細(xì)節(jié)《SANCO/12571/2015 Safety of the Food Chain Chemicals， Contaminants， Pesticides》與其他要求和步驟法案《2002/657/EC Implementing Councial Directive 96/23/EC Concerning the Performance of Analytical Methods and the Inpterpretation of Results》進(jìn)行方法學(xué)參數(shù)考察，包括回收率、精密度、確定限（CCα）和檢測(cè)容量（CCβ）與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

使用CCα和CCβ考察方法檢出限與定量下限，分別為0.001～539 μg/kg與0.001～899 μg/kg。通過(guò)回收率評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，精密度通過(guò)6次平行實(shí)驗(yàn)回收率結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算而得，在基質(zhì)中添加1倍、2倍和4倍CCβ， 制得3個(gè)水平農(nóng)藥殘留的系列混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液，按照2.2.2節(jié)提取凈化后，運(yùn)用UHPLC-Q-Orbitrap MS檢測(cè)。各農(nóng)藥殘留的平均回收率為77%～113%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1%～8.3%，所建立的方法準(zhǔn)確性和精密度良好。

3.4?實(shí)際樣品分析

采用UHPLC-Q-Orbitrap MS篩查93個(gè)批次巴氏殺菌乳與超高溫瞬時(shí)滅菌乳中農(nóng)藥殘留，表2列出了陽(yáng)性樣品的篩查結(jié)果，研究結(jié)果表明，本方法可用于牛乳中外源性風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的快速篩查。

4?結(jié) 論

利用UHPLC-Q-Orbitrap MS，選擇dd-MS2與vDIA兩種二級(jí)掃描方式，分析農(nóng)藥殘留特征斷裂片段，建立農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)，并建立了完整的非定向篩查方法。方法學(xué)驗(yàn)證中，585種農(nóng)藥殘留在線性范圍內(nèi)均具有好的線性關(guān)系，實(shí)現(xiàn)了未知化合物篩查分析方法體系的建立，并將本方法應(yīng)用于巴氏殺菌乳與超高溫瞬時(shí)滅菌乳中農(nóng)藥殘留篩查。

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