黃大兵，王玲玉，潘躍銀

(中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院 安徽省立醫(yī)院腫瘤化療科，安徽 合肥 230001)

惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類生命健康的疾病，已經(jīng)成為中國(guó)居民主要的死亡原因之一，目前臨床治療主要采用手術(shù)、放射治療、化學(xué)治療等，缺乏有效的治療手段。日前，國(guó)家癌癥中心發(fā)布了最新版的2018中國(guó)惡性腫瘤報(bào)告，報(bào)告顯示2018年中國(guó)新增惡性腫瘤病例380.4萬(wàn)例，死亡病例229.6萬(wàn)例。在所有發(fā)病的惡性腫瘤中，肺癌為我國(guó)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其次是胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、女性乳腺癌等，這些均是我國(guó)常見的惡性腫瘤，其中肺癌發(fā)病率約占所有惡性腫瘤新發(fā)病例的77%，肺癌死亡率約占全部惡性腫瘤死亡病例的83%。

鴉膽子作為廣譜抗癌藥，用于對(duì)抗肺癌[1]、胃癌[2]、結(jié)直腸癌[3]、肝癌[4]、女性乳腺癌[5]等，有毒性和不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于臨床。從鴉膽子水提取物中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)鴉膽子苦素AI、鴉膽子苷AP、鴉膽子苦內(nèi)酯AD、鴉膽子苦醇和鴉膽丁等30余種苦木內(nèi)酯類成分?？嗄緝?nèi)酯類是鴉膽子的特征性成分，多數(shù)有抗癌活性[6]?？嗄緝?nèi)酯的抗腫瘤機(jī)制包括：①特異性地抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，從而抑制腫瘤細(xì)胞的DNA合成；②誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和分化；③對(duì)腫瘤細(xì)胞耐藥性產(chǎn)生有一定逆轉(zhuǎn)作用[7]。目前研究發(fā)現(xiàn)鴉膽子活性成分較多，并對(duì)其抗癌作用的分子機(jī)制進(jìn)行了深入的研究，但迄今尚無(wú)一種單一的化合物被用于臨床治療癌癥。本研究擬利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法將鴉膽子多成分、多靶點(diǎn)、多通路、多疾病的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行呈現(xiàn)，探索其有效成分作用的靶點(diǎn)及其治療疾病的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 鴉膽子主要活性成分查找 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP；http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索鴉膽子所含的所有化學(xué)成分。根據(jù)TCMSP的推薦，通過(guò)口服利用度(oral bioavailability，OB)和類藥性(drug-likeness，DL)對(duì)所有化學(xué)成分進(jìn)行篩選。OB是指藥物被吸收進(jìn)入全身循環(huán)系統(tǒng)的程度和速度，是客觀評(píng)價(jià)藥物口服生物利用度和內(nèi)在質(zhì)量的重要指標(biāo)，也是判斷生物活性分子是否具有藥物潛質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)；DL是藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性和安全性的總和(包括溶解度、通透性和穩(wěn)定性等)，與化合物理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)因素的相互作用有關(guān)，是評(píng)價(jià)成藥性優(yōu)劣的關(guān)鍵指標(biāo)，可用于優(yōu)選化合物、解釋活性和DL分析結(jié)果、挖掘活性和DL的關(guān)系、分析化合物特性、預(yù)測(cè)體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征、指導(dǎo)分子結(jié)構(gòu)修飾等?；衔锏腛B、DL越高，表明其越有可能被開發(fā)成為臨床藥物[8-9]。本研究以O(shè)B≥30%、DL≥18%作為篩選條件[10]，對(duì)鴉膽子活性成分進(jìn)行進(jìn)一步篩選。

1.2 構(gòu)建活性成分-靶標(biāo)蛋白網(wǎng)絡(luò) DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)是唯一將詳細(xì)的藥品數(shù)據(jù)(即化學(xué)、藥理學(xué)和制藥)與綜合藥物靶點(diǎn)信息(即序列、結(jié)構(gòu)和作用通路)相結(jié)合的“生物信息學(xué)和化學(xué)信息學(xué)”資源。通過(guò)TCMSP導(dǎo)出鴉膽子活性成分，根據(jù)DrugBank獲取活性成分的潛在靶分子，以構(gòu)建鴉膽子的活性成分-靶標(biāo)蛋白網(wǎng)絡(luò)。

1.3 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network，PPI) String數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)搜尋PPI的數(shù)據(jù)庫(kù)。既包括蛋白質(zhì)之間的直接物理相互作用，也包括蛋白質(zhì)之間的間接功能相關(guān)性。利用String數(shù)據(jù)庫(kù)，置信度(兩個(gè)蛋白質(zhì)相互作用越強(qiáng)連線越粗)設(shè)定為0.9，構(gòu)建這些靶分子的PPI，其中節(jié)點(diǎn)度值最高的基因JUN定義為核心基因，通過(guò)癌癥和腫瘤基因圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)分析其在多種腫瘤的作用。

1.4 通路富集分析 R語(yǔ)言Cluster profiler包，即基因本體(gene ontology，GO)分析和京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析的R包，可以對(duì)基因集合或基因簇進(jìn)行功能聚類的統(tǒng)計(jì)分析和可視化。利用Cluster profiler包將這些靶分子進(jìn)行GO和KEGG富集分析，節(jié)點(diǎn)度值表示網(wǎng)絡(luò)中與節(jié)點(diǎn)相連邊的數(shù)量，節(jié)點(diǎn)大小與其度值成正比；中介中心度主要表示網(wǎng)絡(luò)中最短路徑經(jīng)過(guò)該節(jié)點(diǎn)的數(shù)量占路徑總和的比例，反映該節(jié)點(diǎn)對(duì)整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的作用及影響力。各節(jié)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的參數(shù)值越大，則提示其在網(wǎng)絡(luò)中的樞紐作用越重要[10]。采用差異基因中與該項(xiàng)目相關(guān)的基因數(shù)和矯正后的P值對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)各節(jié)點(diǎn)的重要性進(jìn)行評(píng)估，以評(píng)價(jià)鴉膽子活性成分、靶標(biāo)蛋白的重要程度。

2 結(jié)果

2.1 鴉膽子活性成分篩選結(jié)果和活性成分-靶標(biāo)蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出鴉膽子潛在的活性成分(見表1)：鴉膽苦素C、鴉膽子苦醇、β-谷甾醇、鴉膽苷(B、C_qt、D、H、I、J、L、M、P)、鴉膽苦苷(A_qt、B)、木犀草素。根據(jù)DrugBank獲取活性成分的潛在靶點(diǎn)：毒蕈堿乙酰膽堿受體(M1、M3、M5)、δ型阿片受體、5-羥色胺2A受體、α-1A腎上腺素能受體、μ型阿片受體、半胱胺酸蛋白酶-3、前列腺素G/H合酶1和2(PTGS1、PTGS2)、孕酮受體、一氧化氮合酶、胰島素-1、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體、熱休克蛋白HSP90、1型非受體蛋白酪氨酸磷酸酶、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ等，從而構(gòu)建鴉膽子的活性成分-靶標(biāo)蛋白網(wǎng)絡(luò)(見表2)。利用String數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取活性成分的靶蛋白：轉(zhuǎn)錄因子JUN、轉(zhuǎn)錄因子RELA、抑癌基因TP53、蛋白激酶B1(protein kinase B1，PKB1/Akt1)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等77種靶蛋白(見表3)。置信度設(shè)定為0.9，節(jié)點(diǎn)大小代表度值，構(gòu)建這些靶蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)，靶蛋白及其涉及腫瘤相關(guān)通路之間有著不同程度的關(guān)聯(lián)和重疊部分，其中JUN、RELA、TP53、AKT1、MAPK1、VEGF等節(jié)點(diǎn)值和度值相對(duì)較高(見圖1)。

表1 鴉膽子活性成分

2.2 GO分析和KEGG靶點(diǎn)通路分析 利用R語(yǔ)言Cluster profiler包將這些靶蛋白進(jìn)行GO分析(細(xì)胞組分、分子功能、生物學(xué)過(guò)程)和KEGG靶點(diǎn)通路分析。通過(guò)GO分析，獲取細(xì)胞組分、分子功能、生物學(xué)過(guò)程的富集條目，預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的功能分布，大部分與腫瘤相關(guān)。靶點(diǎn)在細(xì)胞組分中，膜脂筏、膜微區(qū)、膜區(qū)較重要；在分子功能中，蛋白質(zhì)異源二聚反應(yīng)活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、泛素類-蛋白連接酶結(jié)合作用突出；在生物學(xué)過(guò)程中，細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)和對(duì)抗生素反應(yīng)所占比例較大。

通過(guò)KEGG靶點(diǎn)通路分析結(jié)果可知，鴉膽子主要通過(guò)JUN、RELA、TP53、B1(PKB1/AKT1)、TNF、APP、MAPK、VEGF等相關(guān)通路發(fā)揮作用。其中節(jié)點(diǎn)度值最高的基因JUN定義為核心基因，通過(guò)TCGA分析其在多種腫瘤的作用，其在乳腺癌、肺腺癌、肺鱗癌和卵巢癌中均呈現(xiàn)出在腫瘤組織表達(dá)高于正常組織(見圖2)。結(jié)果表明JUN在腫瘤組織的活性高于正常組織，提示其低表達(dá)對(duì)機(jī)體具有保護(hù)作用。

表2 鴉膽子活性成分相關(guān)靶點(diǎn)

表3 鴉膽子活性成分-靶蛋白網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)及其度值

3 討論

中藥活性的體現(xiàn)往往通過(guò)多成分-多靶點(diǎn)-多通路發(fā)揮作用。本研究構(gòu)建的鴉膽子活性成分-靶蛋白通路中，TNF-α信號(hào)通路通過(guò)TNF和腫瘤壞死因子受體1結(jié)合而激活，激活的TNF-α信號(hào)通路可導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子κB核易位和c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38蛋白、JUN活化，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子和TNF-α等的表達(dá)[11-13]。MAPK通路包括MAPK激酶激酶、MAPK激酶和MAPK，這3種激酶能依次激活，共同調(diào)節(jié)著細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、對(duì)環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種重要的細(xì)胞生理/病理過(guò)程。VEGF在內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移中起著重要的作用，為生長(zhǎng)中的腫瘤提供營(yíng)養(yǎng)，使腫瘤細(xì)胞與宿主血管建立連續(xù)性，有研究表明VEGF高表達(dá)的卵巢癌患者預(yù)后差[14]。鴉膽子主要通過(guò)轉(zhuǎn)錄JUN、TNF、MAPK、AKT等相關(guān)因子和靶蛋白參與其相關(guān)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，表明基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)鴉膽子的通路預(yù)測(cè)和靶點(diǎn)篩選具有一定的準(zhǔn)確性。

圖1 鴉膽子活性成分-靶蛋白網(wǎng)絡(luò)

圖2 TCGA分析JUN在乳腺癌、肺腺癌、肺鱗癌和卵巢癌中的作用

本研究構(gòu)建了鴉膽子“多成分-多靶點(diǎn)-多通路”的網(wǎng)絡(luò)圖，其中包括15種活性成分、158種靶點(diǎn)以及相關(guān)成分-靶標(biāo)蛋白網(wǎng)絡(luò)。鴉膽苷、鴉膽苦苷等是其主要抗腫瘤成分，根據(jù)細(xì)胞組分、分子功能、生物學(xué)過(guò)程的富集條目預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的功能分布，大部分與腫瘤相關(guān)。同時(shí)鴉膽子在多種腫瘤中可能通過(guò)TNF、MAPK、VEGF、PI3K/Akt等信號(hào)通路參與抗炎、抗腫瘤等。鴉膽子轉(zhuǎn)錄核心基因JUN，其在腫瘤組織的活性高于正常組織，提示其低表達(dá)對(duì)機(jī)體具有保護(hù)作用。本分析結(jié)果可能為今后研究鴉膽子抗腫瘤機(jī)制提供新依據(jù)和新思路。