郝桂英 易利 潘用清

摘要? ? 為探究山羊源枝睪闊盤吸蟲的種內(nèi)遺傳變異和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，對(duì)采集自四川省涼山州的5個(gè)吸蟲樣品nad4基因部分序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、序列測(cè)定及分析，并構(gòu)建種系發(fā)育樹。測(cè)序結(jié)果顯示，所測(cè)得的5個(gè)山羊源枝睪闊盤吸蟲nad4基因部分序列長(zhǎng)度均為789 bp，核苷酸同源性為99.5%～100.0%，共檢測(cè)到4個(gè)單倍型、4個(gè)變異位點(diǎn)。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，5個(gè)山羊源枝睪闊盤吸蟲涼山州分離株聚在同一小支上，未與胰闊盤吸蟲聚類在一支上，能與其他吸蟲相鑒別。本研究結(jié)果為枝睪闊盤吸蟲的分子分類和種群遺傳的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞? ? 枝睪闊盤吸蟲;山羊;nad4基因;種系發(fā)育

中圖分類號(hào)? ? S8-05? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A? ? ? ? 文章編號(hào)? ?1007-5739（2019）12-0200-02

Abstract? ? In order to study the genetic variations of Eurytrema cladorchis and the phylogentic relationships with other flukes，fragment of nad4 gene of 5 flukes isolated from Liangshan Prefecture in Sichuan Province were amplified by PCR，then analyzed the sequences，and the NJ tree was reconstructed.The results showed that the partial sequences of nad4 gene were 789 bp，with homology was 99.5%～100.0%，four haplotypes were detected in these sequences，with 4 variable sites.The phylogenetic tree showed that the isolates of E. cladorchis from goats in Liangshan were clustered in the same clade，which were not cluster together with E. pancreaticum，can be identified with other flukes.The results of this study could provide the foundation for further research on the molecular classification and population genetics of E. cladorchis.

Key words? ? Eurytrema cladorchis;goat;nad4 gene;phylogenetic

枝睪闊盤吸蟲（Eurytrema cladorchis）隸屬于吸蟲綱（Tr-ematoda）復(fù)殖目（Digenea）雙腔科（Dicrocoeliidae）闊盤屬（Eurytreama）[1]，在牛、羊等反芻動(dòng)物胰腺胰管內(nèi)均有寄生，但不如胰闊盤吸蟲（E. pancreaticum）、腔闊盤吸蟲（E. coel-omaticum）常見[2]。闊盤屬吸蟲致病力低，常常在尸體剖檢或屠宰時(shí)發(fā)現(xiàn)。然而，它能導(dǎo)致動(dòng)物生產(chǎn)性能降低，如體重減輕、產(chǎn)肉量減少，甚至死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成一定經(jīng)濟(jì)損失[3]。

對(duì)枝睪闊盤吸蟲的初步鑒定可通過觀察其形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行，但受環(huán)境、宿主等多種因素的影響，其可靠性、準(zhǔn)確性受到一定的限制。DNA技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于寄生蟲的分類學(xué)研究，其中的DNA序列分析因操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、信息豐富等成為種系發(fā)生學(xué)和分類學(xué)的重要研究工具之一[4]。

nad4基因是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶亞單位4基因的簡(jiǎn)稱，是線粒體上進(jìn)化速率較快的一個(gè)基因，利用它作遺傳標(biāo)記基因?qū)纳{蟲和線蟲進(jìn)行種群遺傳和分類研究已有報(bào)道[5-6]。但目前關(guān)于枝睪闊盤吸蟲分子分類的研究較少，僅見Mohanta等[7]對(duì)孟加拉共和國(guó)瘤牛源枝睪闊盤吸蟲的18S rRNA和ITS2進(jìn)行了研究，未見nad4基因用于枝睪闊盤吸蟲分子鑒別的報(bào)道。

鑒于此，本研究對(duì)采自四川省涼山彝族自治州的5個(gè)山羊枝睪闊盤吸蟲樣品nad4基因部分序列（pnad4）進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列分析，并構(gòu)建枝睪闊盤吸蟲與其他吸蟲的種系發(fā)育關(guān)系，從而明確nad4基因能否成為枝睪闊盤吸蟲理想的遺傳標(biāo)記，以期為今后枝睪闊盤吸蟲的分子分類、種群遺傳結(jié)構(gòu)研究奠定基礎(chǔ)。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗(yàn)材料

1.1.1? ? 供試儀器。電子天平（型號(hào)為FA2204N），購(gòu)自瑞安市安特稱重設(shè)備有限公司;高速離心機(jī)（型號(hào)為TDL-60B），購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠;梯度基因擴(kuò)增儀，購(gòu)自德國(guó)Eppe-ndorf公司;水平電泳儀（型號(hào)為DYY-6C），購(gòu)自北京市六一儀器廠;BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)（型號(hào)為1708195），購(gòu)自美國(guó)伯樂公司。

1.1.2? ? 供試試劑。蛋白酶K購(gòu)自Merck公司，2×Taq PCR Master Mix、DL2000 DNA Marker、GreenView核酸染料、柱式DNA膠回收試劑盒等均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2? ? 試驗(yàn)方法

1.2.1? ?蟲體的采集及保存。從四川省涼山彝族自治州自然感染的5只山羊胰管內(nèi)采集枝睪闊盤吸蟲樣品，用滅菌生理鹽水清洗干凈，進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定后，分別編號(hào)為L(zhǎng)S01～LS05，于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩Ｍ恢簧窖蚍蛛x出的枝睪闊盤吸蟲為1個(gè)分離株。

1.2.2? ? 枝睪闊盤吸蟲蟲體總DNA提取。從冷凍保存的5個(gè)山羊枝睪闊盤吸蟲樣品中分別隨機(jī)取出1條，用剪刀剪碎并研磨，加入1 μg/μL SDS裂解液和10 μg/μL蛋白酶K，放入56 ℃水浴鍋中消化過夜，然后將消化好的蟲體懸液用酚/氯仿法[8]提取蟲體總DNA，保存于-20 ℃條件下備用。

1.2.3? ? 枝睪闊盤吸蟲nad4基因擴(kuò)增及序列測(cè)定。用Chang等[9]報(bào)道的引物進(jìn)行枝睪闊盤吸蟲nad4基因部分序列的擴(kuò)增。由上海杰李生物技術(shù)有限公司合成引物序列，引物序列如下：nad4P1為5′-GTT TTG ATG TTT TTA TGA GT-3′;nad4P2為5′-CTA ATA TGA CGA ACC AGG AA-3′。PCR擴(kuò)增體系為50 μL：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，引物nad4P1、nad4P2（10 pmol/μL）各2 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 19 μL。同時(shí)，以ddH2O作空白對(duì)照。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性40 s，45 ℃復(fù)性40 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸6 min。反應(yīng)結(jié)束后分別取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)目的條帶的大小。各PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化后送上海杰李生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.4? ? 序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化分析。檢索GenBank收錄的部分吸蟲的nad4基因序列并下載（表1），然后用Clustal X 1.81軟件進(jìn)行序列比對(duì)，MEGA 5.0軟件分析堿基組成，基于p-distance模型計(jì)算遺傳距離;用DNAstar 中的MegAlign程序進(jìn)行序列同源性分析;用DnaSP 4.0軟件計(jì)算單倍型數(shù)（ha-plotypes，H）、核苷酸多樣性（Nucleotide diversity，Pi）、單倍型多樣性（Haplotypes diversity，Hd）和平均核苷酸差異（average number of nucleotide differences，K）。以豬帶絳蟲（Taenia soli-um，AB086256）作為系統(tǒng)發(fā)育分析的外群，采用p-distance模型，用MEGA 5.0軟件構(gòu)建NJ樹，并進(jìn)行重復(fù)1 000次的自舉檢驗(yàn)（bootstrap test）。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 枝睪闊盤吸蟲nad4基因部分序列的特征和同源性比較

比對(duì)校正剔除多余序列后，本研究測(cè)得的5個(gè)枝睪闊盤吸蟲涼山州分離株的nad4基因部分序列長(zhǎng)度均為789 bp（占全長(zhǎng)的61.7%），A+T堿基的平均含量為61.4%。5個(gè)測(cè)序序列均不存在堿基插入/缺失，其中保守位點(diǎn)785個(gè)，變異位點(diǎn)4個(gè)（簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)、單變異位點(diǎn)各2個(gè)）。核苷酸變異位點(diǎn)主要發(fā)生在密碼子第1位（占50%），第2位和第3位各占25%，且全為轉(zhuǎn)換（3個(gè)A-G、1個(gè)C-T），無顛換。

5個(gè)枝睪闊盤吸蟲涼山州分離株測(cè)序序列的同源性為99.5%～100.0%，堿基變異率為0～0.5%。5個(gè)測(cè)序序列與胰闊盤吸蟲的同源性為85.8%～85.9%，與矛形雙腔吸蟲、中華雙腔吸蟲、華支睪吸蟲、大片吸蟲、鹿前后盤吸蟲的同源性均低于70%。

2.2? ? 遺傳多樣性分析

5個(gè)山羊源枝睪闊盤吸蟲的nad4基因部分序列共檢測(cè)到4個(gè)單倍型，遺傳距離為0～0.005（平均遺傳距離為0.003），與胰闊盤吸蟲的遺傳距離為0.402～0.406，與矛形雙腔吸蟲、中華雙腔吸蟲、華支睪吸蟲、大片吸蟲、鹿前后盤吸蟲的遺傳距離均≥0.493。5個(gè)測(cè)序序列總的單倍型多樣性（Hd）和核苷酸多樣性（Pi）分別為0.900和0.002 53，平均核苷酸差異（K）為2.000。

2.3? ? 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于nad4基因部分序列構(gòu)建的NJ樹（圖1）顯示，5個(gè)山羊源枝睪闊盤吸蟲涼山州分離株單獨(dú)聚為一支，未與胰闊盤吸蟲聚在一支上，而胰闊盤吸蟲與中華雙腔吸蟲和矛形雙腔吸蟲聚類在同一小支上，與形態(tài)學(xué)分類的結(jié)果不一致。

3? ? 結(jié)論與討論

目前，對(duì)胰闊盤吸蟲和腔闊盤吸蟲的研究主要集中在蟲體形態(tài)結(jié)構(gòu)、發(fā)育過程及闊盤吸蟲病的感染情況調(diào)查、診斷和綜合防治等傳統(tǒng)寄生蟲學(xué)方面，分子水平的研究較少。

用于胰闊盤吸蟲和腔闊盤吸蟲分子分類的靶分子主要有18S rRNA[13-15]、ITS-2[15]，雖然已有胰闊盤吸蟲線粒體基因組全序列的報(bào)道[9]，但并未見基于線粒體基因?qū)σ乳煴P吸蟲、腔闊盤吸蟲、枝睪闊盤吸蟲等進(jìn)行分析的報(bào)道。

本研究對(duì)測(cè)序獲得的5個(gè)山羊源枝睪闊盤吸蟲涼山州分離株的nad4基因部分序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其核苷酸同源性為99.5%～100.0%，平均遺傳距離為0.003，構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示枝睪闊盤吸蟲涼山州樣品位于同一分支，與其他吸蟲得到了很好地鑒別。

本研究對(duì)采集自涼山州山羊源的枝睪闊盤吸蟲nad4基因的部分序列進(jìn)行擴(kuò)增和序列分析，結(jié)果表明，枝睪闊盤吸蟲的nad4基因部分序列種內(nèi)相對(duì)保守，種間差異加大，說明nad4序列片段可作為枝睪闊盤吸蟲種間鑒定及種內(nèi)遺傳變異研究的標(biāo)記。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究枝睪闊盤吸蟲的分子分類、遺傳變異奠定了基礎(chǔ)。

4? ? 參考文獻(xiàn)

[1] 楊光友.獸醫(yī)寄生蟲病學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2015：73-76.

[2] 趙輝元.人獸共患寄生蟲病學(xué)[M].長(zhǎng)春：東北朝鮮民族教育出版社，1998：236.

[3] IIHA M R，LORETTI A P，REIS A.Wasting and mortality in beef cattle parasitized by Eurytrema coelomaticum in the State of Paraná，southern Brazil[J].Vet Parasitol，2005，133（1）：49-60.

[4] MCMANUS D P，BOWLES J.Molecular genetic approaches to parasite identification：Their value in diagnostic parasitology and systematics[J].Int J Parasitol，1996，26（7）：687-704.

[5] 郝桂英.豬囊尾蚴西昌分離株線粒體Cytb和nad4基因的序列測(cè)定與種系發(fā)育分析[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015，36（5）：59-63.

[6] 王燕，楊言川，張悅文，等.羊毛尾線蟲線粒體nad4基因的序列變異分析[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2013，40（4）：81-84.

[7] MOHANTA U K，ICHIKAWA-SEKI M，HAYASHI K，et al. Morphologi-cal and molecular characterization of Eurytrema cladorchis parasitizing cattle（Bos indicus）in Bangladesh [J].Parasitol Res，2015，114（6）：2099-2105.

[8] SAMBROOK J，RUSSEL D W.Molecular cloning. A laboratory manual[M].3rd ed. New York，USA.Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001：463-470.

[9] CHANG Q C，LIU G H，GAO J F，et al.Sequencing and characterization of the complete mitochondrial genome from the pancreatic fluke Eurytrema pancreaticum（Trematoda：Dicrocoeliidae）[J].Gene，2016，576（1）：160-165.

[10] LIU G H，YAN H B，OTRANTO D，et al.Dicrocoelium chinensis and Dicrocoelium dendriticum （Trematoda：Digenea）are distinct lancet fluke species based on mitochondrial and nuclear ribosomal DNA sequences[J].Mol Phylogenet Evol，2014，79（1）：325-331.

[11] CAI X Q，LIU G H，SONG H Q，et al.Sequences and gene organization of the mitochondrial genomes of the liver flukes Opisthorchis viverrini and Clonorchis sinensis（Trematoda）[J].Parasitol Res，110（1）：235-243.

[12] LIU G H，GASSER R B，YOUNG N D，et al.Complete mitochondrial ge-nomes of the‘intermediate formof Fasciola and Fasciola gigantica，and their comparison with F.hepatica[J].Parasit Vectors，2014，7（1）：150.

[13] 鄭亞東，駱學(xué)農(nóng)，施程洪，等.腔闊盤吸蟲18S rRNA及親緣關(guān)系分析[J].中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志， 2006，24（5）：345-358.

[14] ZHENG Y，LUO X，JING Z，et al.Comparison of 18S ribosomal RNA gene sequences of Eurytrema coelmaticum and Eurytrema pancreaticum[J].Parasitol Res，2007，100（3）：645-646.

[15] 常巧呈，鄭旭，段紅，等.基于核糖體18S和ITS2序列探討胰闊盤吸蟲的分子進(jìn)化地位[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，27（4）：50-53.