顏 彥，鐵韋韋，丁澤紅，吳春來，胡 偉

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所, 海南 ?？?571101)

【研究意義】木薯(Manihotesculenta)是三大薯類之一，全球第六大糧食作物，具有抗旱、耐瘠薄、適應性廣、塊根淀粉產(chǎn)率高等特性。目前全球資源日趨緊缺，木薯作為一種高淀粉的生物能源作物，受到越來越多的重視[1]。ASR (abscisic acid, stress, ripening-induced)基因是在植物中發(fā)現(xiàn)的一類脅迫響應基因，廣泛參與植物的干旱脅迫應答，并能提高植物的耐旱性。因此，對木薯ASR基因進行克隆及表達分析，有利于解析ASR基因在木薯耐旱機制中發(fā)揮的作用及調(diào)控途徑。【前人研究進展】Iusem等在1993年首次發(fā)現(xiàn)ASR基因，因其表達受ABA、脅迫和成熟誘導而得名[2]。Hu等研究表明，在煙草中過表達TaASR1基因能提高轉(zhuǎn)基因株系對干旱脅迫的耐受能力，在抗氧化系統(tǒng)中也發(fā)揮著重要作用[3]。玉米ZmASR1蛋白在維持干旱脅迫下玉米產(chǎn)量發(fā)揮著重要作用[4]。將香蕉MpASR基因在擬南芥中過表達，能提高擬南芥對滲透脅迫的耐受性[5]?！颈狙芯壳腥朦c】基于ASR在植物中的重要功能，目前在水稻、玉米、大豆、番茄和蘋果等多種植物中均鑒定出多個ASR基因[6]，而木薯中僅有1個ASR基因被克隆[7]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】克隆木薯MeASR3基因，分析該基因的基本生物信息學特征，檢測MeASR3在ABA處理和多種非生物脅迫下的表達模式，為揭示ASR基因在木薯耐旱機制中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 選取木薯KU50為研究對象，從基地采回木薯莖稈，將其切成包含3～4個芽眼的小節(jié)，插入混有營養(yǎng)土和蛭石的小盆中生長。兩個月后，選取發(fā)育良好且生長一致的木薯幼苗分別進行4種處理，每個處理組均有空白對照，具體為100 μmol/L ABA噴施木薯幼苗2、6、10、24、48、72 h后取葉片，10 mmol/L H2O2澆灌木薯幼苗2、6、10、24、48、72 h后取葉片，200 mmol/L NaCl澆灌木薯幼苗2 h、6 h、3 d、14 d、18 d、24 d后取葉片，300 mmol/L甘露醇澆灌木薯幼苗2 h、6 h、3 d、14 d、18 d、24 d、36 d后取葉片。將采好的樣品經(jīng)液氮速凍后立即放入超低溫冰箱保存。

1.1.2 菌株、載體和試劑 大腸桿菌(E.coli)Top10、pGM-T載體、2×TaqMasterMix、RNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，熒光定量SYBR GreenⅠ試劑盒購自寶生物有限公司， 限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自賽默飛世爾科技有限公司。引物合成和測序由上海生工完成。甘露醇、脫落酸等生化試劑為進口分析純試劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成 提取不同處理下木薯葉片的總RNA，具體步驟參照天根公司RNA提取試劑盒的操作說明。隨后，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存在-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 基因克隆 根據(jù)已有水稻、玉米等植物ASR基因序列，搜索木薯數(shù)據(jù)庫尋找其同源序列，設計引物(ASR3F：5’-ATGGCCGAAGAAAAGCAC’；ASR3R：5’-GAAGAGATGGTGATGTCTT-3’) 以木薯葉片的cDNA為模板進行擴增目的基因，采用天根公司2×TaqMasterMix說明書上推薦的PCR擴增體系和程序。將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定條帶大小正確，回收產(chǎn)物后連接到pGM-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，挑取單克隆在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進行菌液PCR鑒定，將陽性克隆送公司測序。

1.2.3 生物信息學分析 利用在線工具ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)預測MeASR3蛋白的理化性質(zhì)；利用NCBI數(shù)據(jù)庫的Blast程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)查找與MeASR3同源的其他物種的相關(guān)序列，進而使用Clustal X進行多重序列比對；利用MEGA軟件中Neighbor-Joining (NJ)法構(gòu)建進化樹。

1.2.4 基因的表達分析 利用實時熒光定量PCR對目的基因進行表達分析。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，木薯MeEF1基因為內(nèi)參，設計引物(MeASR3引物：QASR3F：5’-CACAACCCAAATCCTTCT-3’，QASR3R：5’-GGTTTCTCCTCGTCCTTA-3’；MeEF1引物：QEF1F：5’-TGAACCACCCTGGTCAGATTGGAA-3’，QEF1R：5’-AACTTGGGCTCCTTCTCAAGCTCT-3’)進行檢測。按照SYBR GreenⅠ試劑盒操作說明 設置熒光定量PCR的反應體系和反應程序。樣品和內(nèi)參均設置了3個技術(shù)重復，結(jié)果分析計算采用2-ΔΔCt法[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeASR3基因的克隆及序列分析

基于木薯數(shù)據(jù)庫中的序列信息，找到一個與水稻ASR家族具有較高同源性的cDNA序列，將其命名為MeASR3。以獲得的木薯幼苗葉片cDNA為模板，設計ASR3F/ASR3R引物擴增得到目的基因(圖1)。將目的基因連接到pGM-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，通過菌液PCR鑒定出陽性單克隆送測序，將測序正確的質(zhì)粒保存在-20 ℃冰箱。

M：DL2000 marker；1：基因cDNA全長擴增結(jié)果M: DL2000 marker; 1: PCR product of the full-length cDNA of MeASR3圖1 木薯MeASR3基因克隆Fig.1 PCR product of MeASR3 from cassava

甜橙(XP_006473073.3)；毛果楊(XP_006383629.2)；ABB基因型香蕉(ACZ60124.1)；歐洲栓皮櫟(XP_023913272.1)Citrus sinensis (XP_006473073.3); Populus trichocarpa (XP_006383629.2); Musa ABB Group (ACZ60124.1); Quercus suber (XP_023913272.1)圖2 MeASR3與其它植物ASR蛋白的多序列比對分析Fig.2 Homologous sequence alignment of MeASR3 and ASR proteins from other plants

利用在線軟件ProtParam對序列進行分析，發(fā)現(xiàn)該基因包含一個459 bp的完整開放閱讀框，編碼153個氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為17.51 kD，原子總數(shù)為2384，分子式為C766H1144N224O249S1；理論等電點為5.87，屬酸性蛋白；親水性平均數(shù)為-1.414，為親水性蛋白。MeASR3中富含丙氨酸(Ala，20個，占13.1 %)，谷氨酸(Glu，25個，占16.3 %)，組氨酸(His，16個，占10.5 %)，賴氨酸(Lys，17個，11.1 %)等氨基酸，與其他植物中報道的ASR的氨基酸組成比例較一致[9-11]。

2.2 MeASR3同源序列比對和進化樹分析

利用NCBI Blast進行檢索其他已知植物中與MeASR3同源的氨基酸序列，利用ClustalX軟件對這些序列進行比對，隨后利用MEGA軟件對這些蛋白質(zhì)序列進行進化關(guān)系分析。結(jié)果表明MeASR3蛋白含有ABA/WDS 超家族的保守結(jié)構(gòu)域以及2個富含His的功能域，這是ASR家族蛋白的主要特征功能域(圖2)。進化樹結(jié)果表明MeASR3與橡膠樹來源的ASR蛋白(XP_021673222.1)親緣關(guān)系最近(圖3)。上述結(jié)果表明MeASR3可能具有ASR家族的功能。

歐洲栓皮櫟(XP_023913272.1)；大豆(NP_001237487.1)；甜橙(XP_006473073.3)；橡膠樹 (XP_021673222.1)；ABB基因型香蕉(ACZ60124.1)；菠蘿(OAY74049.1)；蒺藜苜蓿(XP_013 451861.1)；毛果楊(XP_006383629.2)Quercus suber (XP_023913272.1); Glycine max (NP_001237487.1); Citrus sinensis (XP_006473073.3); Hevea brasiliensis (XP_021673222.1); Musa ABB Group (ACZ60124.1); Ananas comosus (OAY74049.1); Medicago truncatula (XP_013451861.1); Populus trichocarpa (XP_006383629.2)圖3 基于ASR蛋白序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.3 Phylogenetic analysis of MeASR3 and ASR proteins from other plants

2.3 MeASR3基因的表達分析

以木薯MeEF1基因為內(nèi)參，利用實時熒光定量PCR的方法研究了木薯MeASR3基因在多種處理下的表達模式，結(jié)果表明，該基因與木薯的逆境響應密切相關(guān)(圖4)。在ABA處理下，MeASR3的表達水平先下降隨后恢復至正常水平，在處理6 h時表達水平最低。在H2O2的處理下，MeASR3的表達呈現(xiàn)整體上調(diào)的趨勢，在處理2 h時表達量最高。在高鹽脅迫下，MeASR3的表達均上調(diào)，在處理18 d時表達量提高了約2.5倍。在甘露醇處理后2 h至14 d之間，MeASR3的表達均無太大變化，但在處理18 d時表達量增加到對照的11倍左右。

3 討 論

為了應對復雜的自然環(huán)境，植物進化形成了一套完整的信號轉(zhuǎn)導途徑以應對復雜多變的生長環(huán)境。ASR(abscisic acid, stress, ripening-induced)基因是在植物中發(fā)現(xiàn)的一類脅迫響應基因，廣泛參與植物的果實成熟、糖代謝以及脅迫應答等重要的生理過程[12-15]。因此，對ASR基因的克隆和分析有助于解析植物在逆境脅迫下的抵御機制。

本研究利用PCR的方法從木薯品種KU50中成功克隆到一個ASR家族的基因，命名為MeASR3。該基因包含一個459 bp的完整開放閱讀框，編碼153個氨基酸，為親水性蛋白。與其他物種的ASR蛋白進行多序列比對，發(fā)現(xiàn)該基因的氨基酸序列含有ASR家族蛋白的主要特征功能域。進化關(guān)系的分析結(jié)果表明MeASR3與橡膠樹來源的ASR蛋白(XP_021673222.1)聚為一類，驗證了木薯與橡膠樹同屬于大戟科，具有較近的親緣關(guān)系。

A: ABA處理(100 μmol/L ABA); B: 氧化脅迫處理(10 mmol/L H2O2); C: 鹽脅迫處理(200 mmol/L NaCl); D: 模擬干旱處理(300 mmol/L甘露醇)A: ABA treatment (100 μmol/L ABA); B: Oxidative stress (10 mmol/L H2O2); C: Salt stress (200 mmol/L NaCl); D: Drought stress (300 mmol/L mannitol)圖4 MeASR3在多種處理下的表達模式Fig.4 Expression patterns of MeASR3 in response to various treatments

對木薯MeASR3進行多種處理下的表達分析，發(fā)現(xiàn)ABA處理下該基因的表達水平先下調(diào)隨后恢復至對照水平，表明該基因在ABA響應中可能發(fā)揮負調(diào)控作用。這個結(jié)果與水稻OsASR1、OsASR2和OsASR3以及茶樹CsASR3在ABA處理下的表達情況一致[11,16]。在高鹽脅迫和氧化脅迫下，該基因的表達受誘導；在甘露醇模擬的干旱脅迫下，該基因前期表達無顯著變化，但在處理18 d時表達量增加到對照的11倍左右。上述結(jié)果表明MeASR3在木薯抵御鹽脅迫、干旱脅迫以及氧化脅迫中均可能發(fā)揮正向調(diào)控功能。

4 結(jié) 論

克隆獲得木薯MeASR3基因，cDNA長度為459 bp，編碼153個氨基酸，Gene bank登錄號為XM_021744431.1。在ABA處理下，該基因的表達水平先下調(diào)隨后恢復至對照水平；在鹽脅迫、干旱脅迫以及氧化脅迫下，該基因的表達呈上調(diào)趨勢。以上結(jié)果表明MeASR3基因可能在ABA以及多種脅迫下的信號轉(zhuǎn)導途徑中發(fā)揮著不同功能。Chen等發(fā)現(xiàn)草莓FaASR蛋白通過與ABA互作進而調(diào)控草莓的果實成熟過程[17]。將番茄ASR1基因和鹽角草SbASR1基因在煙草中分別進行超表達，發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性均得到提升，同時植株體內(nèi)Na+含量降低，表明這兩個ASR基因可能通過參與信號通路進而調(diào)節(jié)植物Na+的含量，最終提升植株的耐鹽性[18-19]。Li等人發(fā)現(xiàn)在擬南芥和水稻中超表達OsASR5能提高植株的抗旱能力，進一步研究發(fā)現(xiàn)該基因能調(diào)控ABA的合成、參與ABA和H2O2介導的氣孔開閉，同時還能作為分子伴侶蛋白與逆境響應相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)合，通過上述3種途徑OsASR5調(diào)控植株的耐旱性[20]。此外，ASR基因在植物抗重金屬、糖代謝以及抗病中均具有重要作用[21-23]。本研究為后續(xù)深入探索MeASR3參與的信號通路及其互作蛋白及調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。