吳 翔，謝麗源，甘炳成*，陳 影，彭衛(wèi)紅，譚 昊，黃忠乾

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，四川 成都 610066；2. 農(nóng)業(yè)部西南區(qū)域農(nóng)業(yè)微生物資源利用科學(xué)觀測實驗站，四川 成都 610066；3.農(nóng)業(yè)部西南山地農(nóng)業(yè)環(huán)境重點實驗室，四川 成都 610066)

【研究意義】微生物代謝產(chǎn)生活性物質(zhì)的提取、純化一般要經(jīng)過離心、濃縮、萃取、鑒定等繁瑣的程序，它是包括微生物學(xué)、分析化學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科交叉的綜合研究技術(shù)，技術(shù)難度大。更由于微生物代謝產(chǎn)物中活性物質(zhì)的成分是未知的，在不斷的提取、純化過程中要通過活性物質(zhì)的檢測來確定所提取和純化的物質(zhì)是否存在活性成分，更加大了該類實驗研究的難度?！厩叭搜芯窟M展】因此，目前很多關(guān)于微生物代謝產(chǎn)生的活性物質(zhì)的研究是關(guān)于成分的推斷和粗提物的性質(zhì)方面的研究。煙草病害微生物防治研究中針對活性物質(zhì)的研究不多[1-2]，關(guān)于煙草青枯病拮抗菌的活性物質(zhì)研究報道更少，已有的報道主要包括對活性物質(zhì)分子量大小分析和主要成分分析?！颈狙芯壳腥朦c】本研究前期篩選獲得1株對煙草青枯病原菌具有良好拮抗效果的銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)MT-002-B-7，為了初步了解抑菌物質(zhì)的基本性質(zhì)和所含的可能大致成分，對其抑菌活性物質(zhì)進行了研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在探索拮抗活性物質(zhì)成分方面，紅外光譜分析法和GC-MS分析法是常用到的方法，本研究參照目前已有的研究方法，通過對煙草青枯拮抗菌的活性物質(zhì)進行離心、濃縮和萃取，主要研究了拮抗菌MT-002-B-7發(fā)酵液活性提取物質(zhì)的基本性質(zhì)，并結(jié)合紅外光譜和GC-MS的檢測結(jié)果分析和推測其中活性可能成分，探索拮抗菌株的拮抗機理，為多功能生物有機肥的開發(fā)和生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 從高粱根際土中篩選獲得的對煙草青枯病原菌具有較好拮抗效果的銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)MT-002-B-7，該菌為革蘭氏陰性的好氧細(xì)菌。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10.0 g，酵母提取物 5.0 g，NaCl 10.0 g，pH 7.4。

TM培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0 g，葡萄糖 5.0 g，酪素水解物 1.0 g，瓊脂粉 18.0 g。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵液的制備 將MT-002-B-7接入LB培養(yǎng)液中，28 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、培養(yǎng)時間24 h即得到發(fā)酵好的菌液。

1.2.2 抑菌活性檢測方法 將煙草青枯病原菌在TM培養(yǎng)基平皿中培養(yǎng)。用直徑為6 mm的打孔器在空白TM培養(yǎng)皿中央打1個孔，再在離平板中心距離相等的3個方向分別打孔。從培養(yǎng)好的病原菌平皿中打孔出同樣大小菌餅置于空白培養(yǎng)基的中央孔中，四周孔注入30 μl待測粗提液，于28 ℃正置培養(yǎng)，觀測其抑菌情況。

1.2.3 粗提取發(fā)酵液活性產(chǎn)物 將MT-002-B-7發(fā)酵液6000 r/min離心10 min，取上清液用乙醚、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、丙酮以1∶1比例萃取，分別萃取3次，減壓濃縮測定不同有機相和水相的抑菌活性，以對應(yīng)有機溶劑作為對照，試驗重復(fù)3次。

1.2.4 拮抗粗提液穩(wěn)定性測定[2-3]① 拮抗粗提液的熱穩(wěn)定性。將拮抗粗提液分別在30、40、50、60、70、80、90、100 ℃的水浴中加熱30 min，在115、121 ℃的高壓鍋中加熱20 min，以未加熱處理的樣品為對照，檢測各處理液的抑菌活性。② 拮抗粗提液對蛋白酶的穩(wěn)定性。將拮抗粗提液分別用胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K在55 ℃處理3 h，酶反應(yīng)濃度為1 mg/mL，以未用酶處理的為對照，檢測各處理液的抑菌活性。③ 拮抗粗提液對紫外線的穩(wěn)定性。將拮抗粗提液置于8 W紫外光下，距離20 cm，分別照射1、2、4、6、8、10和24 h，以未用紫外光照射為對照，檢測各處理液的抑菌活性。④ 拮抗粗提液活性的有效時間。把拮抗粗提液在室溫條件下(25 ℃左右)放置30 d，分別在第3、5、7、10、15、20和30天取樣，以剛提取的拮抗粗提物的活性為對照，檢測各處理的抑菌活性。⑤ 拮抗粗提液的酸堿穩(wěn)定性。拮抗粗提液用HCl或NaOH分別調(diào)為pH值1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0和14.0 共14個梯度，靜置過夜，再分別調(diào)pH值至中性，以未處理粗提物為對照，檢測各處理的抑菌活性。

1.2.5 粗提物的制備 將發(fā)酵液6000 r/min離心10 min，收集上清液，將上清液和乙酸乙酯1∶1比例萃取，收集有機相，并將有機相于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，濃縮物放置于-20 ℃冰箱預(yù)凍過夜，最后用冷凍干燥機冷凍得到拮抗物質(zhì)干品，備用于后續(xù)試驗。菌株MT-002-B-7經(jīng)冷凍干燥后的拮抗物質(zhì)呈黃白色粉末狀，結(jié)塊處是淡黃色，如圖1所示。

1.2.6 粗提物成分分析 ① 紅外光譜掃描。將拮抗提取物與干燥的KBr研磨混勻，壓片，所制片送往中國科學(xué)院成都分院分析測試中心用紅外光譜儀在4000～500 cm-1區(qū)間掃描。②氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定化學(xué)成分，將拮抗提取凍干產(chǎn)物送往青島科標(biāo)化工分析檢測有限公司，用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對其成分進行檢測，具體檢測條件如下：取少量樣品用水溶解，再取少量溶液滴加到乙酸乙酯和丙酮1∶1的混合溶液中，混勻、過濾、上機。

圖1 冷凍干燥后的拮抗物質(zhì)Fig.1 Freeze-dried antibiotics production

表1 溶劑萃取成分抑菌活性比較

注：“-”表示無抑菌圈，“NA”表示不溶。

Note: ‘-’ means no inhibitory zone ;‘NA’ means not applicable.

用0.45 μm微孔濾膜過濾，TG-5 MS型色譜柱的升溫速率為：初始柱溫60 ℃，保持5 min，以3.5 ℃/min升溫到100 ℃，保持5 min，以8 ℃/min升溫到200 ℃，保持5 min，以15 ℃/min升溫到280 ℃，保持15 min。以不接菌培養(yǎng)液作為對照，分別測定化學(xué)物質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性代謝產(chǎn)物萃取溶劑的研究

選取乙醚、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、丙酮等有機溶劑對發(fā)酵液進行萃取，分別測定其水相和有機相抑菌活性，試驗結(jié)果如表1所示，表中的數(shù)據(jù)表明各提取相的抑菌圈大小。用丙酮進行萃取時，出現(xiàn)乳化現(xiàn)象無法分層，因此不能檢測其萃取后的結(jié)果。而活性物質(zhì)在氯仿、乙醚、正丁醇等萃取液中沒有抑菌活性，說明該物質(zhì)不溶于此類有機溶劑，而溶于乙酸乙酯等有機溶劑。根據(jù)相似相溶原理，該物質(zhì)能被乙酸乙酯萃取，證明活性物質(zhì)的極性與乙酸乙酯更為接近，因此選用乙酸乙酯作為發(fā)酵上清液的萃取溶劑。

2.2 拮抗粗提液穩(wěn)定性

2.2.1 熱穩(wěn)定性 粗提液在經(jīng)過30～121 ℃不同溫度階段處理后，檢測其抑菌活性，對照測得抑菌圈大小為34.11 mm，結(jié)果如圖2所示。粗提液在30～90 ℃溫度區(qū)間基本能保持抑菌活性穩(wěn)定，活性同對照相比相差不大，沒有達(dá)到顯著性差異(P>0.05)。但在90 ℃水浴處理后其活性開始有所下降，之后隨著處理溫度的升高活性逐漸下降，100、115和121 ℃處理后較對照分別下降3.66 %、7.48 %和8.74 %，由此可以看出高于100 ℃，隨著溫度升高，活性略有降低。由此得知，拮抗活性物質(zhì)具有一定的熱穩(wěn)定性。

圖2 拮抗提取物的熱穩(wěn)定性Fig.2 Thermostability of extractive

圖3 不同蛋白酶對拮抗提取物抑菌活性的影響Fig.3 Effects of different protease on activity of crude extract

2.2.2 對蛋白酶的穩(wěn)定性 用3種不同蛋白酶處理粗提液，以不處理為對照，對照抑菌圈大小為34.11 mm，檢測其對煙草青枯病原菌的抑制效果，結(jié)果如圖3所示。經(jīng)胃蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶處理后的蛋白酶處理液抑菌圈與對照相比相差不大，沒有達(dá)到顯著差異(P>0.05)，說明粗提液抑菌活性對蛋白酶不敏感。由此推測，拮抗物質(zhì)中可能不含有蛋白質(zhì)成分。

2.2.3 對紫外線的穩(wěn)定性 粗提液經(jīng)過紫外線照射后，隨著照射時間的增加，抑菌活性逐漸降低，如圖4所示。紫外照射1、2、4和6 h的抑菌活性與對照34.11 mm的抑菌圈相比沒有達(dá)到顯著性差異(P>0.05)，當(dāng)照射8 h，抑菌活性顯著降低(P<0.05)，抑菌活性為對照的79.7 %，當(dāng)照射24 h時，抑菌活性極顯著低于對照(P<0.01)，抑菌活性僅為對照的64.3 %。研究結(jié)果表明，紫外照射時間低于6 h對拮抗物質(zhì)抑菌活性沒有明顯影響，而照射時間超過6 h，拮抗物質(zhì)的抑菌活性顯著下降，直到10 h后變化不大。

圖4 紫外線照射對拮抗提取物抑菌活性的影響Fig.4 Effects of ultraviolet radiation on activity of crude extract

圖5 保存時間對拮抗提取物抑菌活性的影響Fig.5 Effects of store time on activity of crude extract

2.2.4 拮抗物質(zhì)活性的有效時間 拮抗物質(zhì)活性隨時間的保持能力對該類物質(zhì)的應(yīng)用開發(fā)非常重要，是考察其應(yīng)用潛力的重要指標(biāo)。在放置拮抗物質(zhì)的30 d中，檢測了的7次拮抗提取物質(zhì)樣品抑菌活性，結(jié)果如圖5所示。不同時間段的檢測抑菌活性與對照相比沒有達(dá)到顯著差異(P>0.05)，說明拮抗物質(zhì)的抑菌活性并沒有因為放置時間的延長而降低。

2.2.5 酸堿穩(wěn)定性 實驗未經(jīng)處理粗提物的抑菌圈大小為32.67 mm。如圖6所示，pH值對粗提液的抑菌活性影響很大，在試驗的不同pH值范圍，抑菌圈直徑處于3個主要的階段。當(dāng)pH 1～4抑菌活性較低，且不同pH間抑菌活性相差不大(P>0.05)；pH 5～7具有較高的抑菌活性，活性相當(dāng)于對照的88.5 %～91.4 %，但當(dāng)pH調(diào)整至8之后，抑菌活性急劇下降，極顯著(P<0.01)低于pH 5～7時粗提液抑菌活性。由此可見，粗提液在微酸至中性條件下具有較好地抑菌活性，偏酸或偏堿都不能很好地維持粗提液的抑菌活性。盡管經(jīng)過pH 1和pH 14處理，檢測結(jié)果說明粗提液的抑菌活性仍然存在，說明拮抗物質(zhì)具有較廣的pH耐受能力。

2.3 粗提物活性成分分析

2.3.1 紅外光譜掃描分析 參考胡皆漢等人編寫的《實用紅外光譜學(xué)》對圖譜進行分析[4]，從圖7可以看出，在3430.0、2962.1、1639.5、1455.7、1407.8、1331.6、1246.2、1080.3、1038.2 cm-1有吸收峰，其中在其特征頻率區(qū)波數(shù)1639.5、2962.1 cm-1表示分子中可能含有羧基和α，β-不飽和內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，3430.0 cm-1可能是O-H伸縮振動峰，1038.2 cm-1可能是C-H苯環(huán)1、3、5取代峰，1331.6、1246.2 cm-1可能是C=O伸縮振動峰(也可能是C=C振動峰)，1455.7和1407.8 cm-1可能是C=H面內(nèi)彎曲振動峰，919.9 cm-1可能是-CH2面外變形振動峰，875.5 cm-1可能是=C-H振動峰，840.8 cm-1可能是-C-H面外變形振動峰。

圖6 拮抗提取物的酸堿穩(wěn)定性Fig.6 The stability of extractive on different pH

圖7 拮抗物質(zhì)紅外吸收光譜Fig.7 IR spectrum of the antibiotics production

2.3.2 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測拮抗物質(zhì)成分 由圖8分析可知，樣品中含有脂肪酸、斑蝥素、5-乙酰基四氫呋喃-2-酮、3-甲基-6-異丙基-2,5-哌嗪二酮、環(huán)(甘氨?；涟彼?、N-乙酰-3-甲基-1,4-二氮雜雙環(huán)[4.3.0]-壬烷-2,5-二酮、六氫吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮、脯氨酸環(huán)二肽、3,6-二(甲基丙基)-2,5-哌嗪二酮、吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮、酚嗪等成分。

在培養(yǎng)基中檢測出的多種物質(zhì)中，與樣品中具有相同類別的成分為六氫吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮、3,6-二(甲基丙基)-2,5-哌嗪二酮和吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮，并且前兩者含量和樣品中的相差不大，因此判斷樣品中的這兩種物質(zhì)由于不被菌株生長所轉(zhuǎn)化，在樣品中繼續(xù)檢出，是培養(yǎng)基中所含有而非菌株生長代謝產(chǎn)物；樣品中檢出的吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和脯氨酸環(huán)二肽的含量低于培養(yǎng)基中，判斷是菌株生長中部分轉(zhuǎn)化利用了該物質(zhì)，檢出的為剩余部分，因此該物質(zhì)也非菌株生長代謝產(chǎn)物；培養(yǎng)基中檢出的、但沒有在樣品中檢測出的其它類物質(zhì)推斷為被菌株在生長過程中轉(zhuǎn)化利用了，培養(yǎng)基和樣品中各檢出成分及含量如表2所示。

綜上所述，GC-MS掃描分析揭示出樣品所含的成分為脂肪酸、斑蝥素、5-乙酰基四氫呋喃-2-酮、3-甲基-6-異丙基-2,5-哌嗪二酮、環(huán)(甘氨?；涟彼?、N-乙酰-3-甲基-1,4-二氮雜雙環(huán)[4.3.0]-壬烷-2,5-二酮、酚嗪等成分。其中含量最高的前3類物質(zhì)為: 11.99 %的N-乙酰-3-甲基-1,4-二氮雜雙環(huán)[4.3.0]-壬烷-2,5-二酮、6.02 %脂肪酸和3.69 %的酚嗪，其它幾類物質(zhì)的含量相對較低。

圖8 GC-MS檢測培養(yǎng)基(a)和樣品(b)中的成分Fig.8 Components of control and sample on GC-MS

3 討 論

分析結(jié)果表明，拮抗物質(zhì)不能被供試的多數(shù)有機溶劑萃取，只有乙酸乙酯能部分萃取出活性成分。已有的研究報道說明，乙酸乙酯可作為多種植物的病原拮抗菌活性成分的萃取有機溶劑[5-7]，說明多種植物的病原拮抗菌活性成分具有和乙酸乙酯相似的極性。

菌株MT-002-B-7的粗提液抑菌活性對蛋白酶不敏感，由此推斷粗提物中可能不含有蛋白質(zhì)成分。通過紅外光譜和GC-MS成分掃描分析可知，拮抗物質(zhì)中可能含有脂肪酸、斑蝥素、5-乙酰基四氫呋喃-2-酮、3-甲基-6-異丙基-2,5-哌嗪二酮、環(huán)(甘氨酰基亮氨酸)、N-乙酰-3-甲基-1,4-二氮雜雙環(huán)[4.3.0]-壬烷-2,5-二酮、酚嗪等成分。其中紅外光譜圖中1639.5 cm-1是仲胺類NH彎(面內(nèi))彎曲振動峰，是脯氨酸環(huán)二肽或者甘氨?；涟彼岬奶卣鞣?，1331、1246、1080.3、1038.2 cm-1是叔胺類C-N振動峰(1350～1020 cm-1)；1639.5 cm-1應(yīng)該是1-酮基-2羥基(或氨基)芳酮，是N-乙酰-3-甲基-1,4-二氮雜雙環(huán)[4，3，0]-壬烷-2,5-二酮的特征峰；1407.8 cm-1為羥基面內(nèi)彎曲振動的峰(1440～1375 cm-1)，是脂肪酸的特征峰；1246.2 cm-1為結(jié)晶性長鏈脂肪酸固相特征峰。因此，進一步結(jié)合GC-MS掃描成分含量比例，認(rèn)為拮抗物質(zhì)主要為N-乙酰-3-甲基-1,4-二氮雜雙環(huán)[4.3.0]-壬烷-2,5-二酮、脂肪酸和酚嗪。陳亮等的研究結(jié)果表明，抑制煙草青枯病的活性成分主要為環(huán)二肽-(酪氨酸-亮氨酸)[8]，該成分與本研究分析所得的環(huán)(甘氨酰基亮氨酸)具有相似的結(jié)構(gòu)模式，都具有2個氨基酸組成的環(huán)二肽。而其它關(guān)于煙草青枯病拮抗菌中活性成分分析的研究報道較少，易有金[9]張秀玉[10]測出拮抗物質(zhì)的大概分子量，董昆明的研究結(jié)果表明拮抗煙草青枯病原菌的活性成分是由13種不同的化合物組成的混合物，但未確定13種化合物成分[11]。

表2 通過GC-MS檢測出的培養(yǎng)基和樣品中所含的物質(zhì)

但本研究中由于乙酸乙酯不能完全萃取吸附發(fā)酵液的活性物質(zhì)，可能導(dǎo)致紅外光譜和GC-MS檢測出的物質(zhì)有遺漏。另外GC-MS分析時，粗提物中是否所有的活性物質(zhì)都被氣化檢出，其中被檢出的各種物質(zhì)是否能單獨或協(xié)同抑制煙草青枯病原菌都有待更多的研究來分析和驗證。

4 結(jié) 論

(1)結(jié)果表明菌株MT-002-B-7的拮抗活性物質(zhì)和乙酸乙酯的極性相似，具有一定的熱穩(wěn)定性，對蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶不敏感，抑菌活性不受保存時間的影響。但當(dāng)8w紫外線照射的時間超過8 h，pH<5和pH>8的條件會顯著降低粗提物的抑菌活性。

(2)結(jié)合分析紅外光譜結(jié)果和GC-MS檢測結(jié)果，初步認(rèn)為拮抗物質(zhì)中主要的成分是N-乙酰-3-甲基-1,4-二氮雜雙環(huán)[4.3.0]-壬烷-2,5-二酮、脂肪酸、酚嗪、斑蝥素、5-乙酰基四氫呋喃-2-酮、3-甲基-6-異丙基-2,5-哌嗪二酮、環(huán)(甘氨?；涟彼?等成分，其中前3種含量最高，分別是11.99 %、6.02 %和3.69 %，其它幾類物質(zhì)的含量相對較小。