高金波， 侯麗然， 李國(guó)清， 張?jiān)平埽?彭 翔

(1.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007； 2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007； 3.哈爾濱學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080)

0 引 言

桔梗為藥食兩用植物，是桔?？?Campanulaceae)植物桔梗 Platycodon grandiflorum (Jacq.)A. DC. 的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]。已有研究表明桔梗中的化學(xué)成分主要有：桔梗皂苷、酚類化合物、黃酮類化合物等[2,3]。其中的桔梗皂苷具有祛痰、鎮(zhèn)痛、抗炎、保肝、降脂等作用[4]。根據(jù)桔梗皂苷的結(jié)構(gòu)可知：分子中和分子間均有一定的網(wǎng)狀空間，溶液中的小分子或離子可以進(jìn)入網(wǎng)狀空間，具有一定的分散能力[5]。硒是人體的必須微量元素之一，是人體合成許多酶的重要組成部分，具有清除自由基、解除重金屬的毒害與致癌性物質(zhì)傷害[6]。自1994年張勁松、高學(xué)云博士率先研制出納米硒之后，紅色的納米硒因其低的毒性和高的生物活性越來(lái)越備受關(guān)注[7]。近年來(lái)關(guān)于納米硒的應(yīng)用研究主要集中在光電子方面，鮮有利用納米硒參與谷胱甘肽過氧化物酶進(jìn)行保肝的研究。筆者已開展過利用納米硒進(jìn)行保肝的研究[8,9]，取得了一些進(jìn)展，為尋找更穩(wěn)定和更好的保肝物質(zhì)，本文利用桔梗中的總皂苷作為分散劑制備紅色的納米硒，研究其對(duì)CCl4所致的肝損傷的保護(hù)作用，希望為保肝護(hù)肝提供有益的參考。

1 儀器與試劑

AU 2700全自動(dòng)生化分析儀(1600T/h，日本OLYMPUS公司生產(chǎn))，TGL16M臺(tái)式高速低溫冷凍離心機(jī) 上海赫田科學(xué)儀器有限公司，B×41 光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS )。

SPF級(jí)昆明種雄性小鼠(佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；CCl4(分析純，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司)；聯(lián)苯雙酯滴丸(1.5mg×500丸，北京協(xié)和藥廠)；谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)試劑盒(日本，和光純藥工業(yè)株式會(huì)社)；丙二醛(MDA)試劑盒和還原型谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；其他試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 桔?？傇碥盏奶崛∨c處理

取干燥的桔梗，粉碎，過篩，稱取50 g，30倍的蒸餾水，在60℃水浴，超聲頻率為1000W條件下超聲60 min，四層紗布過濾，濾渣在上述條件下重復(fù)提取1次，合并濾液。濾液經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，濃縮液上101型大孔樹脂柱，分別用蒸餾水和70%的乙醇洗脫，收集乙醇部分，濃縮至干，得桔?？傇碥?。

2.2 以桔?？傇碥諡榉稚┲苽銹LD-NSe0的方法

稱取0.1 g的桔?？傇碥?，加500 mL蒸餾水，在溫度40 ℃下加入亞硒酸鈉0.10g，攪拌30min，使其均勻地分散，再以1 mL/min的速度滴加維生素C(Na2SeO3與Vc的摩爾比為1∶3)，繼續(xù)攪拌4 h，濃縮后，醇沉，離心。

2.3 桔梗皂苷-納米硒復(fù)合物的保肝作用研究

2.3.1 動(dòng)物分組及模型的建立

將48只雄性昆明種小鼠(SPF級(jí))隨機(jī)分成6組，分別為正常組，陰性模型組，陽(yáng)性聯(lián)苯雙酯組，高、中、低劑量組，每組8只。正常飼養(yǎng)3d，稱重，PLD-NSe0低、中、高劑量組分別按照40 mg/kg、50 mg/kg、60 mg/kg(含硒量)灌胃給藥，陽(yáng)性組灌聯(lián)苯雙脂200 mg/kg，正常組和陰性模型組按照100mL/kg灌胃生理鹽水，連續(xù)灌胃給藥14d，在第7d和第14d給藥1h后，稱重，除正常組外，各組小鼠按照10 mg/kg腹腔注射0.2%的CCl4橄欖油溶液。

2.3.2 血清和肝組織樣本制備

在第14 d給藥24 h后，稱體重，眼球取血，血液于3500 r/min條件下低溫離心15 min，取上清作為血清樣本。將小鼠處死后摘取肝組織，用生理鹽水沖洗，濾紙拭干，稱重，計(jì)算肝指數(shù)(肝重/體重×100%)，取肝臟組織0.2 g，加預(yù)冷的9倍于組織塊重的生理鹽水，制備成10 %的肝組織勻漿液。將勻漿以3500r/min離心10～15min，取上清液作為肝組織勻漿液，備用。

2.3.3 血清肝功能各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)

取血清樣本0.5mL于全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、球蛋白(GLB)、白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)的含量，用以評(píng)價(jià)肝功能損傷程度。

2.3.4 肝組織中MDA含量和GSH-Px活力測(cè)定

取肝組織勻漿液，按照試劑盒要求測(cè)定并計(jì)算肝組織勻漿中MDA含量和GSH-Px活力。

2.3.5 病理組織學(xué)觀察

選取小鼠右側(cè)肝葉，置于10% 中性甲醛溶液中固定，按常規(guī)方法制備蠟塊，切片，蘇木素-伊紅 (HE) 染色，封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織細(xì)胞的變化。

2.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用統(tǒng)計(jì)SPSS 18.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，在多組肝功能各項(xiàng)指標(biāo)、MDA和GSH-Px的數(shù)據(jù)分析中，采用SPSS中的單因素方差分析法(One-Way Anova)，進(jìn)行多重比較時(shí)，采用SPSS中的最小顯著性法(LSD)。

3 結(jié)果與討論

3.1 對(duì)小鼠體重的影響

按照2.3.1方法小鼠造模成功后，將小鼠稱重并計(jì)算各組小鼠體重的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，匯總與表1。

表1 小鼠體重(g)值

根據(jù)0d～7d(ΔW0d-7d)的結(jié)果比較分析，正常組與聯(lián)苯雙酯組增加幅度較小，PLD-NSe0組的體重差隨劑量增加，小鼠體重增長(zhǎng)幅度變大。陰性組與低劑量組增長(zhǎng)幅度幾近相同。7d～14d與0d～7d體重差比較可知，正常組、聯(lián)苯雙酯組、PLD-NSe0高、中劑量組體重增長(zhǎng)速度近乎相同，PLD-NSe0劑量組體重増長(zhǎng)變緩，陰性組體重增長(zhǎng)最慢，可推測(cè)CCl4造成小鼠肝細(xì)胞損傷，得了肝損傷，從而導(dǎo)致消化道不適，造成食欲差的結(jié)果。

3.2 對(duì)小鼠肝重及肝臟指數(shù)

由肝指數(shù)與組別之間繪制的柱狀圖如圖1可看出，與正常組比較，陰性組小鼠肝重和肝指數(shù)存在極顯著性差異(p<0.01)表明造模成功，而陽(yáng)性聯(lián)苯雙酯組較正常組差異較小，說(shuō)明聯(lián)苯雙酯具有保護(hù)和治療作用；與陰性組比較，PLD-NSe0藥物治療組肝重與肝指數(shù)均明顯低于陰性組且存在顯著性差異(p<0.05)，與正常組和聯(lián)苯雙酯組無(wú)明顯差異，說(shuō)明PLD-NSe0有明顯的保護(hù)肝臟和治療肝損傷的效果，且治療效果與PLD-NSe0的劑量正相關(guān)，可推測(cè)PLD-NSe0有助于修復(fù)肝細(xì)胞，使肝重指數(shù)降低的作用。

3.3 血清中酶的各種酶的變化

測(cè)定血清中TP、ALB、ALT、AST、GLB、ALP的酶活力，以評(píng)價(jià)肝損傷程度，測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 小鼠肝功能測(cè)定結(jié)果

注：與正常組比較，*：p<0.01 ；與陰性組比較，#：p<0.05 ◆：p<0.01；與陽(yáng)性組比較，^：p<0.05, ☉：p<0.01

由表2知，陰性組與正常組相比，陰性組小鼠血清中ALT、AST、ALP、GLB水平明顯升高，均有極顯著性差異(p<0.01)；陰性組小鼠血清中TP、ALB水平明顯低于正常組，有極顯著性差異(p<0.01)，說(shuō)明CCl4引起的小鼠急性肝損傷的模型制造成功。聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性組與陰性模型組相比TP、ALB、ALT、AST、ALP、GLB均有極顯著性差異(p<0.01)，且與正常組差異較小，說(shuō)明聯(lián)苯雙酯滴丸有明顯預(yù)防保護(hù)作用。PLD-NSe0低、中劑量治療組較陰性組的TP、ALB水平明顯升高，ALT、AST、ALP、GLB水平較陰性組明顯降低，高劑量組則存在極顯著性差異(p<0.01)，說(shuō)明高劑量組治療效果與陽(yáng)性聯(lián)苯雙酯組相當(dāng)。

圖1 肝重指數(shù)柱圖

3.4 PLD-NSe0對(duì)肝組織中MDA的含量的影響

由于CCl4在體內(nèi)產(chǎn)生自由基引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而損傷肝細(xì)胞，而丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，因此MDA的含量可以間接反應(yīng)出肝細(xì)胞的破壞程度。由表3小鼠肝組織中MDA的含量結(jié)果可知，陰性組與正常組比較，陰性組中的MDA含量劇增，較正常組存在極顯著性差異(p<0.01)；聯(lián)苯雙酯組與陰性組比較，MDA含量降低存在極顯著性差異(p<0.05)，說(shuō)明聯(lián)苯雙酯滴丸起到了保護(hù)和治療效果，PLD-NSe0組隨著劑量的增加，MDA含量降低，且PLD-NSe0高劑量組較聯(lián)苯雙酯組無(wú)顯著性差異，說(shuō)明PLD-NSe0也具有保護(hù)肝臟的作用，且效果與劑量成正比。

表3小鼠肝組織中MDA的含量和GSH-Px活力值

MDAGSH-Px 正常組7.00±1.86241.27±45.99陰性對(duì)照組12.27±2.49?163.47±24.45?陽(yáng)性對(duì)照組8.54±1.36 ?232.10±58.70?多糖高劑量組8.82±2.20220.80±42.37#多糖中劑量組9.22±1.05 196.11±34.20?#多糖低劑量組10.95±1.54?☉169.98±47.26?^

注：與正常組比較，*：p<0.01 ；與陰性組比較，◆：p<0.01；與陽(yáng)性組比較，☉：p<0.01

3.5 PLD-NSe0對(duì)肝組織中GSH-Px活力的影響

谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)是生物體內(nèi)廣泛存在的一種過氧化物分解酶，其活力降低會(huì)使機(jī)體抗氧化能力下降，由表3中GSH-Px活力值可看出，陰性組與正常組比較，陰性組較正常組GSH-Px活性降低，并存在極顯著性差異(p<0.01)，說(shuō)明造模成功；PLD-NSe0治療組與陰性組比較，PLD-NSe0治療組均可使GSH-Px活性升高，且PLD-NSe0高、中劑量組與陰性組存在顯著性差異(p<0.05)，推測(cè)PLD-NSe0可增強(qiáng)GSH-Px的活力，修復(fù)損傷的肝細(xì)胞，起到保肝作用。

3.6 肝組織病理學(xué)結(jié)果

圖4為肝組織HE的染色結(jié)果。由圖4可以看出，正常組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞排列整齊，邊界明顯，肝組織細(xì)胞沒有水腫、玻璃樣變性等；模型組肝組織細(xì)胞形態(tài)模糊，組織細(xì)胞有明顯的氣球樣變性和玻璃樣變性，且嗜伊紅增強(qiáng)，說(shuō)明肝細(xì)胞損傷嚴(yán)重；聯(lián)苯雙酯組肝細(xì)胞水腫減輕，嗜伊紅現(xiàn)象減弱，肝細(xì)胞排列較為整齊，形態(tài)較為清晰；PLD-NSe0低劑量組較模型組嗜伊紅面積減小，水腫現(xiàn)象減輕；PLD-NSe0高劑量組和中劑量組相對(duì)于陰性組而言嗜伊紅面積和玻璃樣變組織細(xì)胞均明顯減少，細(xì)胞核明顯，形態(tài)清晰，幾乎沒有細(xì)胞水腫，與聯(lián)苯雙酯組基本相近，表明PLD-NSe0高、中劑量有很好的保護(hù)肝組織和修復(fù)肝細(xì)胞損傷的作用。

圖2 肝組織HE染色結(jié)果(HE染色，×200)

4 結(jié) 論

PLD-NSe0能夠降低由CCl4所致的急性肝損傷小鼠血清中ALT、AST、ALP水平和GLB含量，升高TP、ALB含量，并能夠使肝組織中GSH-Px活力增強(qiáng)，MDA含量降低。證明PLD-NSe0對(duì)急性肝損傷有一定治療注作用，且治療效果高劑量組>中劑量組>低劑量組，高劑量組與陽(yáng)性相對(duì)照組治療效果經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析無(wú)顯著差異，即療效相當(dāng)?？蔀镻LD-NSe0藥用價(jià)值的進(jìn)一步開發(fā)和綜合利用奠定理論基礎(chǔ)，并為臨床防治肝病用藥的開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。