孔杰　 周洲　 劉偉　 趙鳳　 王金樂

摘要：通過對(duì)線粒體細(xì)胞色素b（Cyt b）基因和控制區(qū)（D-loop）進(jìn)行序列特征和遺傳多樣性檢測(cè)，分析達(dá)氏鰉（Huso dauricus）親魚群體30個(gè)個(gè)體的序列特征及遺傳多樣性。結(jié)果表明，Cyt b基因長(zhǎng)1 138 bp，G+C含量為4703%，共定義單倍型5個(gè)、多態(tài)性位點(diǎn)（S）2個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)1個(gè)，單倍型多樣性指數(shù)（Hd）為0.372，平均核苷酸差異數(shù)（K）為0.384，核苷酸多樣性指數(shù)（π）為 0.000 34;D-loop區(qū)序列全長(zhǎng)845 bp，G+C含量為37.41%，共定義單倍型6個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)8個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)3個(gè)，單倍型多樣性指數(shù)為0.424，平均核苷酸差異數(shù)為1.069，核苷酸多樣性指數(shù)為0.001 27?；诰€粒體D-loop與Cyt b序列的研究結(jié)果表明，養(yǎng)殖達(dá)氏鰉親魚群體的遺傳多樣性偏低，在利用達(dá)氏鰉親魚進(jìn)行繁殖育苗時(shí)要注意近交的影響。

關(guān)鍵詞：達(dá)氏鰉;mtDNA;D-loop;Cyt b;遺傳多樣性

中圖分類號(hào)： S917.4? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）03-0040-03

達(dá)氏鰉（Huso dauricus）隸屬于硬骨魚綱輻鰭亞綱鱘科鱘亞科鰉屬，是我國(guó)重要的大型經(jīng)濟(jì)魚類之一。鱘形目魚類屬于多倍體起源魚類，種間極易雜交，易造成種質(zhì)混亂現(xiàn)象，產(chǎn)生種質(zhì)退化風(fēng)險(xiǎn)。在養(yǎng)殖中，許多單位將自養(yǎng)鱘魚留作苗種，長(zhǎng)期以來忽略了親魚選育的遺傳背景問題，使得養(yǎng)殖群體近交的風(fēng)險(xiǎn)增大[1]。因此，為了抑制養(yǎng)殖群體的種質(zhì)退化，保證親魚群體的遺傳力，防止近交衰退造成后代出現(xiàn)成活率降低、長(zhǎng)速減慢等問題，有必要了解后備親魚群體的遺傳多樣性。

線粒體DNA（mitochondrial DNA，簡(jiǎn)稱mtDNA）具有母系遺傳、變異率高、進(jìn)化速度快、無組織特異性的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于水生動(dòng)物的遺傳多樣性和分子鑒定研究中，如鱘鰉魚[1-2]、鯉[3]的分子鑒定，鱘魚[4-6]、沼蝦[7-8]、裂腹魚[9-10]等的遺傳多樣性研究。mtDNA的不同區(qū)域進(jìn)化速度存在差異，其中，D-loop區(qū)位于tRNAPro和rRNAPhe基因之間的控制區(qū)，不參與編碼蛋白，是整個(gè)mtDNA上序列和長(zhǎng)度變異最大的區(qū)域，進(jìn)化速度快，適用于親緣關(guān)系較近的群體間的比較研究和種群水平的差異檢測(cè)[11-12];Cyt b基因是編碼基因，進(jìn)化速度適中，適合魚類的種間、種內(nèi)遺傳分化研究[12-13]。結(jié)合Cyt b、D-loop 2種分子標(biāo)記可以更準(zhǔn)確地進(jìn)行魚類種內(nèi)遺傳變異分析。

本研究以達(dá)氏鰉親魚群體為研究對(duì)象，開展mtDNA Cyt b基因和D-loop的序列對(duì)比分析，探討2種標(biāo)記用于達(dá)氏鰉遺傳多樣性分析的優(yōu)缺點(diǎn)，旨在研究達(dá)氏鰉后備親魚群體的遺傳多樣性，為達(dá)氏鰉遺傳選育提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2017年3月于貴州省水產(chǎn)研究所惠水試驗(yàn)基地采集達(dá)氏鰉親魚群體30尾。剪取尾鰭，固定于無水乙醇中，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組提取及擴(kuò)增

剪取質(zhì)量約為50 mg鱘魚鰭條樣本，加液氮研磨組織后，用磁珠法基因組DNA（動(dòng)物）抽提試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]進(jìn)行DNA提取，DNA的質(zhì)量與濃度用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop Lite（Thermo Scientific）紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

用于擴(kuò)增目的片段Cyt b的引物：Cytb-F，5′-GTGACTTGAAAAACCACCGTTG-3′;Cytb-R，5′-CTCCATCTCCGGTTTACAAGAC-3′。用于擴(kuò)增D-loop區(qū)序列的引物：tpro-F1，5′-AACTCCCAAAGCTAAGATTC-3′;tphe-R2，5′-ATCCTTTAvGTTAAGCTACGC-3′。PCR反應(yīng)總體積為50 μL，含有100 ng模板DNA，25 μL Premix Taq，各1 μL上下游引物（10 μmol/L），加無菌水補(bǔ)足總體積為50 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 4 min;95 ℃ 45 s，54 ℃/56 ℃（D-Loop/Cyt b）45 s，72 ℃ 90 s/2 min（D-Loop/Cyt b），35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸8 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用MEGA 6.0軟件進(jìn)行同源比對(duì)和長(zhǎng)度確定，并統(tǒng)計(jì)DNA序列的堿基組成，轉(zhuǎn)換/顛換、插入/缺失位點(diǎn)數(shù)，多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)（S），單突變位點(diǎn)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)和平均轉(zhuǎn)換/顛換率。用DnaSP 5.0軟件統(tǒng)計(jì)單倍型數(shù)量（h）、單倍型多樣性指數(shù)（Hd）、核苷酸多樣性指數(shù)（π）、平均核苷酸差異數(shù)（K）和Tajimas D值等遺傳多樣性參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 達(dá)氏鰉Cyt b基因和D-loop序列的特征及遺傳變異

測(cè)序獲得的30尾達(dá)氏鰉Cyt b基因序列的全長(zhǎng)為 1 138 bp，定義了5個(gè)單倍型。用MEGA 6.0軟件對(duì)Cyt b基因序列進(jìn)行分析顯示，檢測(cè)到多態(tài)位點(diǎn)2個(gè)，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)1個(gè)，單突變位點(diǎn)1個(gè)，為顛換位點(diǎn)（T→C）。在30個(gè)個(gè)體的Cyt b基因中，A、T/U、C、G堿基的平均含量分別為 26.96%、26.01%、31.82%、15.21%，A+T的含量（52.97%）明顯高于G+C的含量（47.03%），基于最大似然法估算的轉(zhuǎn)換/顛換比為0.472。

測(cè)序獲得30尾達(dá)氏鰉D-loop區(qū)序列的全長(zhǎng)為845 bp，定義了6個(gè)單倍型。用MEGA 6.0軟件對(duì)D-loop區(qū)進(jìn)行分析顯示，檢測(cè)到多態(tài)位點(diǎn)8個(gè)，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)3個(gè)，單突變位點(diǎn)5個(gè)，但多態(tài)位點(diǎn)中轉(zhuǎn)換位點(diǎn)2個(gè)，顛換位點(diǎn)3個(gè)?；谧畲笏迫环ü浪愕霓D(zhuǎn)換/顛換比為2.162。30個(gè)個(gè)體的 D-loop中，A、T/U、C、G堿基的平均含量分別為30.28%、32.31%、14.92%、22.49%，A+T的含量（62.59%）明顯高于G+C的含量（37.41%）。對(duì)比分析可知，Cyt b的簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)、變異位點(diǎn)數(shù)、轉(zhuǎn)換/顛換位點(diǎn)數(shù)及單突變位點(diǎn)數(shù)均比 D-loop少，詳見表1。

2.2 基于Cyt b基因和D-loop序列的遺傳多樣性分析

基于Cyt b基因的達(dá)氏鰉親魚養(yǎng)殖群體的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為2個(gè)，單倍型數(shù)量為5個(gè)，單倍型多樣性指數(shù)為0.372，核苷酸多樣性指數(shù)為0.000 34，平均核苷酸差異為0.384，Tajimas D值為 -1.613 75。基于D-loop序列的達(dá)氏鰉親魚養(yǎng)殖群體多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為8個(gè)，單倍型數(shù)量為6個(gè)，單倍型多樣性指數(shù)為0.424，核苷酸多樣性指數(shù)為0.001 27，平均核苷酸差異數(shù)為1.069，Tajimas D值為-1.576 74（表2）。

3 討論

3.1 達(dá)氏鰉群體的mtDNA Cyt b和D-loop序列組成特征

4種堿基組成含量不均一是動(dòng)物線粒體基因組的共性，G+C含量在21%～50%之間，其中脊椎動(dòng)物的G+C含量為37%～50%[14]。然而，堿基A+T含量高的線粒體基因在進(jìn)化中更具優(yōu)勢(shì)[15]。本研究結(jié)果顯示，達(dá)氏鰉群體Cyt b、D-loop全序列的G+C含量分別為47.03%、37.41%，顯著低于其A+T含量52.97%、62.59%（P<0.01），且D-loop的 A+T含量比Cyt b高近10%，表明達(dá)氏鰉群體與其他水生動(dòng)物，如粗唇[16]、鯽[17]、香魚[18]的線粒體核苷酸堿基含量相似。在本研究中，Cyt b基因的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)量（2個(gè)）低于D-loop區(qū)（8個(gè)），Cyt b基因的簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)量（1個(gè)）低于D-loop區(qū)（3個(gè)），也再一次證明了D-loop的進(jìn)化速率比Cyt b快，這是由于Cyt b基因是蛋白質(zhì)的編碼基因，而 D-loop 是一段非編碼區(qū)，與線粒體基因調(diào)控有關(guān)，進(jìn)化壓力較小。

從30條長(zhǎng)1 138 bp的達(dá)氏鰉Cyt b序列中共檢測(cè)到2個(gè)突變位點(diǎn)，占總分析位點(diǎn)數(shù)的0.2%。從30條長(zhǎng)845 bp的 D-loop序列中共檢測(cè)到8個(gè)突變位點(diǎn)，占總分析位點(diǎn)數(shù)的0.9%。在生物體的進(jìn)化中，顛換不斷積累，因此轉(zhuǎn)換/顛換值不斷降低，一般認(rèn)為轉(zhuǎn)換/顛換值小于2時(shí)，基因序列突變已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)[19]。在本研究中，基于最大似然法計(jì)算 Cyt b、D-loop的轉(zhuǎn)換/顛換值（R值）分別為0.472、2.162，Cyt b的R值小于2，D-loop的R值略大于2，表明Cyt b發(fā)生的突變已經(jīng)達(dá)到飽和，而D-loop還有進(jìn)一步突變的空間。由此可見，D-loop更適合用來進(jìn)行達(dá)氏鰉的種內(nèi)遺傳分析。

3.2 達(dá)氏鰉親魚群體遺傳多樣性的分析

單倍型多樣性指數(shù)及核苷酸多樣性指數(shù)是衡量種群遺傳變異的重要指標(biāo)，其數(shù)值越大，代表種群遺傳多樣性越豐富[20]，遺傳多樣性越豐富，該物種對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力越強(qiáng)[21]。由于核苷酸多樣性指數(shù)考慮了各種單倍型在種群中所占的比例，因此在衡量一個(gè)種群的多態(tài)性程度時(shí)，比單純的單倍型多樣性指數(shù)要準(zhǔn)確，π值高，則說明種群的遺傳多樣性較高[22]。牛翠娟等通過D-loop序列對(duì)達(dá)氏鰉群體的遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，單倍型多樣性指數(shù)為0.507，核苷酸多樣性指數(shù)為0.002，并得出遺傳多樣性偏低的結(jié)論[6]。王巍等對(duì)4種鱘魚的遺傳多樣性分析的結(jié)果顯示，施氏鱘（π=0.002，Hd=0.608）、小體鱘（π=0.010，Hd=0.572）、西伯利亞鱘（π=0.005，Hd=0.706）、俄羅斯鱘（π=0.005，Hd=0.352）4種后備親魚群體的遺傳多樣性偏低[5]。從其他魚類的遺傳多樣性來看，香魚群體D-loop的π=0.001 99，Hd=0.810 75，Cyt b的π=0.000 28，Hd=0.323，遺傳水平較低[18];赤眼鱒野生群體D-loop的 π=0.028 4，Hd=0.963，Cyt b的π=0.042 6，Hd=0.971 0，赤眼鱒群體具有較高的遺傳多樣性水平[12]。本研究基于mtDNA Cyt b基因、D-loop序列，研究達(dá)氏鰉親魚群體的遺傳多樣性，結(jié)果顯示，Cyt b的核苷酸多樣性指數(shù)、單倍型多樣性（π=0.000 34，Hd=0372）和D-loop的核苷酸多樣性指數(shù)、單倍型多樣性指數(shù)（π=0.001 27，Hd=0.424）均低于以上各種魚類的相應(yīng)遺傳參數(shù)，表明本研究中的30尾達(dá)氏鰉親魚群體的遺傳多樣性較低。本研究結(jié)果初步反映了達(dá)氏鰉親魚群體的遺傳背景、遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳變異水平，可以采用核基因組分子標(biāo)記如簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）、單核苷酸多態(tài)性（SNP）等聯(lián)合分析，以更全面地展示該群體的遺傳多樣性，為親魚選育、苗種培育提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]郭向賀. 五種鱘鰉魚種質(zhì)鑒定及遺傳多樣性分析[D]. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014：73.

[2]胡 佳，汪登強(qiáng)，危起偉，等. 施氏鱘、達(dá)氏鰉及其雜交子代的分子鑒定[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2010，17（1）：21-30.

[3]蘇勝?gòu)?，董在杰，朱文? 4個(gè)線粒體基因在鯉所屬國(guó)家種質(zhì)鑒定中的應(yīng)用及效果評(píng)價(jià)[J]. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2017，38（1）：45-51.

[4]向 燕，孔 杰，周 洲，等. 鱘魚養(yǎng)殖親魚群體遺傳多樣性分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，26（5）：2112-2115.

[5]王 巍，朱 華，胡紅霞. 4種鱘魚養(yǎng)殖親魚群體遺傳多樣性分析[J]. 動(dòng)物學(xué)雜志，2012，47（1）：105-111.

[6]牛翠娟，胡紅霞，羅 靜，等. 史氏鱘和達(dá)氏鰉養(yǎng)殖親魚群體遺傳多樣性分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2010，34（12）：1795-1799.

[7]董新培，武小斌，萬海付，等. 河北3個(gè)日本沼蝦野生群體線粒體DNA D-Loop基因序列變異及種群遺傳結(jié)構(gòu)分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2017，41（2）：182-188.

[8]楊 頻，張 浩，陳立僑，等. 利用CO Ⅰ基因序列分析長(zhǎng)江與瀾滄江水系日本沼蝦群體的遺傳結(jié)構(gòu)（英文）[J]. 動(dòng)物學(xué)研究，2007，28（2）：113-118.

[9]張爭(zhēng)世，胡冰潔，葉祥益，等. 基于mtDNA Cyt b序列分析齊口裂腹魚群體遺傳多樣性[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2017，41（3）：609-616.

[10]孟 瑋，郭 焱，海 薩，等. 塔里木裂腹魚群體遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性分析[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2012，36（5）：851-857.

[11]黃志堅(jiān)，徐曉鵬，唐晶晶，等. 淡水魚類線粒體DNA D-loop基因的引物設(shè)計(jì)和應(yīng)用[J]. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，48（4）：84-88.

[12]楊慧榮，趙會(huì)宏，蒙子寧，等. 赤眼鱒線粒體D-loop和Cyt b基因序列的對(duì)比分析[J]. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，51（5）：100-106，136.

[13]馬 亞，岳志芹，趙玉然，等. 松江鱸魚Cyt b基因序列分析及種質(zhì)鑒定[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2012（8）：119-124.

[14]黃 原. 分子系統(tǒng)學(xué)——原理，方法及應(yīng)用[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1998：65.

[15]Folmer O，Black M，Hoeh W，et al. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit Ⅰ from diverse metazoan invertebrates[J]. Molecular Marine Biology and Biotechnology，1994，3（5）：294-299.

[16]劉 偉，代應(yīng)貴，袁振興，等. 都柳江粗唇種群線粒體DNA Cyt b基因和D-loop序列組成及遺傳多樣性[J]. 淡水漁業(yè)，2016，46（3）：10-15，51.

[17]胡玉婷，胡 王，凌 俊，等. 滁州鯽線粒體細(xì)胞色素b基因和控制區(qū)序列比較及其系統(tǒng)進(jìn)化分析[J]. 南方水產(chǎn)科學(xué)，2015，11（2）：101-108.

[18]李 娜，陳少波，謝起浪，等. 閩浙地區(qū)香魚線粒體Cyt b基因和D-loop區(qū)序列多態(tài)性分析[J]. 遺傳，2008，30（7）：919-925.

[19]吳 靜，張 研，霍堂斌，等. 利用線粒體序列分析黑龍江和松花江流域?yàn)跆K里擬鲿種群遺傳結(jié)構(gòu)[J]. 淡水漁業(yè)，2013，43（2）：16-20.

[20]張久盤. 基于mtDNA Cyt b基因和D-loop祁連山裸鯉遺傳多樣性及分類地位分析[D]. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015：43.

[21]Knight A，Mindell D P. Substitution bias，weighting of DNA sequence evolution，and the phylogenetic position of Feas viper[J]. Systematic Biology，1993，42（1）：18-31.

[22]Zhou H，Li D，Zhang Y，et al. Study on mitochondrial DNA genetic diversity of Tibetan antelope[J]. Hereditas，2006，28（3）：299-305.袁 遠(yuǎn)，高 熹，喜 超，等. 椰子織蛾CSP基因的克隆與序列分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（3）：43-46.