魏復(fù)群，羅柳平，梁東，林承杰，王壘，曾永毅

（福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院 肝膽外科，福建 福州 350025）

原發(fā)性肝癌（以下簡稱肝癌）是全世界發(fā)生率及病死率最高的惡性腫瘤之一，隨著外科技術(shù)的發(fā)展，越來越多的肝癌患者受益于根治性手術(shù)切除，但術(shù)后5年復(fù)發(fā)率仍高達(dá)70%[1]；術(shù)后預(yù)防性肝動脈化療栓塞（transarterial chemoembolization，TACE）是肝癌根治性切除術(shù)后常用的預(yù)防復(fù)發(fā)手段之一，TACE能提早發(fā)現(xiàn)微病灶、微轉(zhuǎn)移，殺死殘留癌組織，提早治療，有效防止復(fù)發(fā)，提高生存率[2-4]；腫瘤增殖細(xì)胞的比例是其生物侵蝕性的重要標(biāo)志，核抗原Ki-67免疫組化檢測是評估細(xì)胞增殖最常用的方法[5]；目前許多研究已報道Ki-67的表達(dá)與肝癌預(yù)后密切相關(guān)[6-7]；而Ki-67評分與肝癌根治性切除術(shù)后行預(yù)防性TACE患者預(yù)后關(guān)系未曾被報道。因此，本文采用免疫組化法對我院150例肝癌根治性切除術(shù)后行預(yù)防性TACE患者的肝癌組織進(jìn)行Ki-67檢測，探討Ki-67評分與預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 病例資料

采用回顧性隊列研究，收集150例肝癌根治性切除術(shù)后行預(yù)防性TACE患者的臨床病理資料，其中男130例，女20例，中位年齡55（26～76）歲。Ki-67陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)波動于2%～97%，平均（20.42±1.24）%，中位數(shù)為20%；根據(jù)Ki-67

陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的中位數(shù)進(jìn)行分組：Ki-67評分≤20%為低表達(dá)組，Ki-67評分＞20%為高表達(dá)組，低表達(dá)組44例，高表達(dá)組106例。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 術(shù)后病理確診為肝細(xì)胞性肝癌；⑵ 術(shù)前肝功能Child-Pugh分級A級；⑶ 手術(shù)為根治性手術(shù)；⑷ 術(shù)后只接受1次TACE；⑸ 術(shù)前未接受其他抗腫瘤治療（如射頻、TACE、免疫治療等）；⑹ 沒有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或手術(shù)禁忌。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 術(shù)前發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；⑵ 合并其他原發(fā)性惡性腫瘤；⑶ 合并影像學(xué)及肉眼可見的膽管或血管癌栓；⑷ 術(shù)前接受其他非手術(shù)治療；⑸ 臨床病理資料不全。復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)：增強(qiáng)CT、增強(qiáng)MRI及超聲造影中兩項檢查發(fā)現(xiàn)肝癌典型“快進(jìn)快出”特征確診。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審批，批號為（No.2018-042-01）。

1.2 方法

1.2.1 肝癌根治性切除術(shù)中判斷標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 肝靜脈、門靜脈、膽管以及下腔靜脈未見肉眼癌栓；⑵ 無鄰近臟器侵犯，無肝門淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；⑶ 肝臟切緣距腫瘤邊界＞1 cm；如切緣＜1 cm，但切除肝斷面組織學(xué)檢查無腫瘤細(xì)胞殘留，即切緣陰性。術(shù)后判斷標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 術(shù)后2個月行超聲、CT、MRI（必須有其中兩項）檢查未發(fā)現(xiàn)腫瘤病灶；⑵ 如術(shù)前AFP升高，則要求術(shù)后2個月AFP定量測定，其水平在正常范圍[8]。

1.2.2 解剖性肝切除與非解剖性肝切除解剖性肝切除標(biāo)準(zhǔn)：進(jìn)腹后行術(shù)中B超定位，確定擬切除的肝實(shí)質(zhì)范圍。在對第一肝門進(jìn)行解剖時，根據(jù)預(yù)切除肝臟的范圍，解剖、離斷預(yù)切除肝臟的肝動脈、門靜脈。若行肝右前、右后葉、左內(nèi)葉、左外葉、左半肝、右半肝和右三葉切除時應(yīng)在第一肝門處離斷供應(yīng)上述肝實(shí)質(zhì)的門靜脈及肝動脈分支。肝實(shí)質(zhì)離斷用鉗夾法。常規(guī)在切肝時與Glisson鞘一起離斷肝管，而不在肝門處游離。對肝斷面一般不縫合處理。非解剖性肝切除標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)預(yù)切除肝臟的部位和大小相應(yīng)的肝血管阻斷方法，本組所有患者均采用Pringle入肝血流阻斷法。在距離腫瘤邊界1～2 cm處電刀電凝標(biāo)記出預(yù)切除線。鉗夾法離斷肝實(shí)質(zhì)切除腫瘤[9]。

1.2.3 預(yù)防性TACE采用Seldinger法，即經(jīng)皮穿刺右股動脈，先超選至肝固有動脈，注入化療藥物 5-FU 750 mg 及奧沙利鉑 150 mg，微導(dǎo)管超選至腫瘤供血分支，注入碘油與表柔比星30 mg的混合乳液，可加用明膠海綿顆粒，根據(jù)病灶大小，血供情況還可以選擇載藥微球，PVA栓塞顆粒等栓塞材料，栓塞以腫瘤滋養(yǎng)血管不顯影為度；TACE治療時間為根治性切除術(shù)后2個月內(nèi)。

圖1 免疫組化檢測Ki-67在肝癌中組織中的表達(dá) A：Ki-67低表達(dá)（×200）；B：Ki-67高表達(dá)（×200）；C：Ki-67低表達(dá)（×400）；D：Ki-67高表達(dá)（×400）Figure1 Immunohistochemical staining for Ki-67expression of in liver cancer tissue A:Low Ki-67 expression (×200)；B:High Ki-67 expression (×200)；C:Low Ki-67 expression (×400)；D:High ki-67 expression (×400)

1.2.4 Ki-67檢測所有患者的腫瘤組織樣本均采用免疫染色法[10]進(jìn)行分析。所有肝癌的組織標(biāo)本均經(jīng)過10%甲醛固定，常規(guī)脫水包埋，切成4 μm厚切片，以小鼠抗人Ki-67單克隆抗體（MIB-1，福州邁新）進(jìn)行Ki-67免疫染色，低溫孵育過夜，漂洗后用3，3'-二氨基聯(lián)苯胺（DAB，美國 DAKO 公司）顯色，最后切片用蘇木精復(fù)染。結(jié)果判定：由兩個有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師共同閱片，光學(xué)顯微鏡下（×400，Olympus BX53，日本）觀察細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為Ki-67陽性細(xì)胞，每張切片選取5個高倍視野隨機(jī)觀察，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，計算出每個視野的陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，取其平均值（圖1）。

1.2.5 隨訪采用住院復(fù)查和門診電話方式進(jìn)行隨訪，患者預(yù)防性TACE術(shù)后第1年每3個月復(fù)查1次CT或MRI和血清AFP，1年后每半年復(fù)查1次CT或MRI，一旦診斷復(fù)發(fā)，根據(jù)情況行再次手術(shù)、射頻、TACE、保守治療，死亡為隨訪終止時間，隨訪時間截至2018年1月31日。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用χ2檢驗(yàn)對分類數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，用Kaplan-Merier方法估算無病生存期（DFS）和總生存期（OS），采用多變量Cox回歸模型的正演方法，進(jìn)行單因素及多因素分析。P＜0.05均被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 臨床病理資料分析

分析結(jié)果顯示，K i-6 7評分高低與腫瘤數(shù)目、腫瘤包膜有無、是否合并微血管癌栓有明顯關(guān)系（均P＜0.05），而與性別、年齡、凝血酶原時間（PT）、總膽紅素（TBIL）水平、白蛋白（ALB）水平、HBV-DNA載量、AFP水平、是否合并肝硬化、手術(shù)方式、腫瘤部位、腫瘤大小、切緣距離、分化程度均無明顯關(guān)系（均P＞0.05）（表1）。

表1 Ki-67表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系[n（%）]Table1 Relations of Ki-67 expression with the clinicopathologic factors[n (%)]

2.2 影響肝癌根治性切除術(shù)后行預(yù)防性TACE患者DFS及OS的單因素及多因素分析

影響DFS單因素分析：AFP＞400 ng/mL、非解剖性肝切除、腫瘤多發(fā)、腫瘤大、Ki-67高表達(dá)為DFS的影響因素（均P＜0.05）；影響DFS多因素分析：腫瘤多發(fā)、腫瘤大、Ki-67高表達(dá)為影響DFS的獨(dú)立危險因素（均P＜0.05）（表2）。影響OS單因素分析：男性、腫瘤多發(fā)、腫瘤大、腫瘤包膜不完整、合并微血管癌栓、Ki-67高表達(dá)為OS的影響因素影（均P＜0.05）；影響OS多因素分析：腫瘤多發(fā)、腫瘤大、腫瘤包膜不完整、合并微血管癌栓、Ki-67高表達(dá)為影響OS的獨(dú)立危險因素（均P＜0.05）（表3）。

表2 原發(fā)性肝癌根治性切除術(shù)后行預(yù)防性TACE患者DSF危險因素分析Table2 Analysis of the risk factors for DSF in patients with prophylactic TACE after radical hepatectomy for primary liver cancer

表3 原發(fā)性肝癌根治性切除術(shù)后行預(yù)防性TACE患者OS危險因素分析Table3 Analysis of the risk factors for OS in patients with prophylactic TACE after radical hepatectomy for primary liver cancer

2.3 Ki-67評分與肝癌根治性切除術(shù)后行預(yù)防性TACE患者DFS及OS關(guān)系

低表達(dá)組和高表達(dá)組復(fù)發(fā)率分別為37.7%和57.9%，兩組患者無瘤生存期差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.777，P＜0.05）。低表達(dá)組和高表達(dá)組患者生存率分別為75.9%和45.6%，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.447，P＜0.05）（圖2）。

圖2 Ki-67高表達(dá)組與低表達(dá)組患者Kaplan-Meier生存曲線 A：DFS曲線；B：OS曲線Figure2 Kaplan-Meier survival curves of the patients in high and low Ki-67 expression groups A:DFS curves；B:OS curves

3 討 論

肝癌根治性切除術(shù)后行預(yù)防性TACE能提早發(fā)現(xiàn)微病灶、微轉(zhuǎn)移，殺死殘留癌組織，改善患者預(yù)后[11-12]，且載藥微球與傳統(tǒng)碘油栓塞效果無顯著差別[13]；近年來，許多學(xué)者提出僅部分肝癌患者能從預(yù)防性TACE中獲益，研究[2,14-15]發(fā)現(xiàn)按MVI等級分組后合并MVI組更能從預(yù)防性TACE治療中獲益；Liao等[16]指出當(dāng)肝癌直徑＞5 cm更能從預(yù)防性TACE治療中獲益；Hsiao等[17]發(fā)現(xiàn)在多發(fā)性肝癌的患者中，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移比多中心起源的患者更能從預(yù)防性TACE治療中獲益；此外，Huang等[18]結(jié)合腫瘤包膜、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、腫瘤切緣及MVI設(shè)計預(yù)防性TACE治療獲益評分系統(tǒng)，得分越高，越能從中獲益。本文旨在探討Ki-67評分與肝癌根治性切除術(shù)后行預(yù)防性TACE患者預(yù)后關(guān)系。

腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)是反應(yīng)腫瘤生物學(xué)特性的重要參數(shù)[19]，影響腫瘤術(shù)后治療的有效性；Ki-67是一種傳統(tǒng)的增殖標(biāo)志物，在細(xì)胞周期的G1、S和G2期達(dá)到高峰，而在G0期缺失，在許多腫瘤中高表達(dá)，Ki-67標(biāo)志物的變化能可靠地反映正常和病變組織的增殖活性，對腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有預(yù)測作用；眾多研究已報道Ki-67與腫瘤臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，包括：乳腺癌、垂體腺瘤、喉癌、腎上腺皮質(zhì)癌、套淋巴瘤和卵巢癌等[20-24]。目前很多研究表明Ki-67與肝癌預(yù)后密切相關(guān)[25-29]，肝癌組織Ki-67高表達(dá)常常與組織分化差、腫瘤大、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯及肝外轉(zhuǎn)移相關(guān)；有研究表明，Ki-67降低細(xì)胞間的黏附力，使腫瘤細(xì)胞從腫瘤分離并與細(xì)胞外基質(zhì)黏附，能促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[30]，本研究同樣發(fā)現(xiàn)，在Ki-67高低表達(dá)組中，腫瘤包膜是否完整、腫瘤數(shù)目、是否合并微血管癌栓的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與上述研究結(jié)果相仿。

以往的研究中[2,15,18]表明，肝癌根治性術(shù)后合并高危因素如腫瘤大、MVI、腫瘤多發(fā)等建議行TACE術(shù)，Ki-67常常與這些肝癌復(fù)發(fā)高危因素相關(guān)[31]；然而本研究結(jié)果提示，在肝癌根治性切除術(shù)后行預(yù)防性TACE患者中，Ki-67低表達(dá)組無瘤生存期及總生存期均超過Ki-67高表達(dá)組，原因可能是預(yù)防性TACE僅僅行肝動脈栓塞，而Ki-67高表達(dá)組微血管侵犯率高于低表達(dá)組（64.15% vs.50%，P＜0.05），導(dǎo)致早期復(fù)發(fā)，影響預(yù)后；因此，在評估原發(fā)性肝癌根治術(shù)后行預(yù)防性TACE患者預(yù)后時，Ki-67表達(dá)可能是一個重要參考指標(biāo)。

本研究多因素分析結(jié)果顯示腫瘤多發(fā)、腫瘤大、Ki-67高表達(dá)是影響肝癌根治性切除術(shù)患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素，這與以往的報道相一致；研究[32]顯示腫瘤的直徑＜5 cm的肝癌患者根治術(shù)后5年生存率為58.2%、10年生存率為38.4%，而腫瘤直徑＞5 cm的肝癌患者根治術(shù)后5年生存率下降至31.4%、10年生存率降至20.43%；研究[33]顯示腫瘤單發(fā)的肝癌患者根治術(shù)后5年生存率為65.8%，而腫瘤多發(fā)的肝癌患者根治術(shù)后5年生存率下降至45.8%。

本研究仍有如下不足：⑴ 單中心并且是回顧性研究，一個前瞻、多中心、隨機(jī)的臨床試驗(yàn)是需要的；⑵ 本研究未納入丙型肝炎、酒精性肝炎及脂肪肝相關(guān)性肝癌；⑶ 患者復(fù)發(fā)后不同治療方式可能影響研究結(jié)果，需進(jìn)一步探究。

綜上所述，Ki-67高表達(dá)為肝癌根治性切除術(shù)后行預(yù)防性TACE患者預(yù)后不良因素之一。