高明燕 韋玉勇 周 生 徐 步

中國農業(yè)科學院家禽研究所，江蘇揚州225125

20世紀70、80年代，禽霍亂對國內的養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經濟損失。隨著規(guī)?；B(yǎng)殖技術的提高，抗生素在臨床的應用以及生物安全措施的重視，該病的危害大大降低,但有關該病的病例報道還時有發(fā)生。為深入了解當前家禽養(yǎng)殖業(yè)中禽多殺性巴氏桿菌病流行情況，筆者在2009-2017年共9年間對江蘇、安徽、山東、浙江等地區(qū)進行了流行病學調查。共采集1 556 份禽霍亂臨床疑似病例，同時進行了Pm 菌株分離。采用菌落特征觀察、革蘭氏染色、生化試驗及Pm 種特異性PCR 等方法進行菌株鑒定，并對這些菌株進行莢膜血清型和LPS 基因型分型，為該病的流行病學監(jiān)測和疫苗的篩選與研制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 病 料

采樣時間：2009-2017年。

病料來源:江蘇、安徽、山東、浙江等地區(qū)1 556份臨床禽霍亂疑似病例，主要是肝臟、脾臟、心血等病料。

1.2 參考菌株

國內強毒標準株C48-1（A:1）；莢膜血清型參考株CVCC390(A)、CVCC391(B)、CVCC392(D)；Heddleston 菌體血清型參考株CVCC410（1 型，屬于LPS 基因型L1）、CVCC412（3 型，屬于LPS 基因型L3）、CVCC413（4，屬于脂多糖基因型L3），均源自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 試 劑

腦心浸液BHI (brain heart infusion )培養(yǎng)基、腦心浸液瓊脂BHIA(brain heart Infusion agar)培養(yǎng)基為美國BD 公司產品；普通營養(yǎng)瓊脂、血瓊脂基礎、普通肉湯、麥康凱培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基以及生化發(fā)酵管均購自杭州微生物試劑有限公司。聚合酶、DNA Marker 為寶生物工程（大連）有限公司產品。

1.4 菌株分離與鑒定

1）觸片檢查。將疑似禽霍亂病死禽用手術剪刀解剖，暴露出內臟組織；灼燒剪刀并把心臟內壁剪一個小口，用接種棒蘸取少量心血涂在載玻片上制成心血涂片；同時無菌剪取肝臟和脾臟病變組織各一小塊制成觸片；然后將上述涂片和觸片進行革蘭氏染色。

2）細菌分離培養(yǎng)及生化特性。按上述無菌操作從病死禽的心血、肝臟和脾臟取樣，接種于BHIA 平板，37 ℃培養(yǎng)18～24 h；挑選單個菌落進行純培養(yǎng)，在45°折光光源下，用立體顯微鏡觀察菌落的大小、形態(tài)、結構及虹彩。將上述分離菌株轉接種于普通營養(yǎng)瓊脂、血瓊脂、麥康凱培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基等的平皿上，置37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落在各個平皿上的生長狀況。挑取上述菌株的單個菌落，分別接種于各微量生化發(fā)酵管內，置37 ℃培養(yǎng)24～48 h，定時檢查反應結果。

1.5 菌種特異性PCR 鑒定

BHI 或BHIA 平板培養(yǎng)分離的菌株，直接取菌液或平板上的單菌落直接進行PCR。按參考文獻[5]合成針對禽Pm 菌株KMT1 基因的特異性引物KM T1T7：ATCCGCTATTTACCCAGTGG 和KMT1SP6：GCTGTAAACGAACTCGCCAC。PCR 擴增50 μL 體系：Premix Ex Taq混合物25 μL，模板1 μL，上下游引物各2 μL，ddH2O 20 μL。PCR 擴增條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min，35 個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。經1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產物。

1.6 多重莢膜PCR 鑒定

按參考文獻[5]的方法合成針對莢膜A、B、D、E、F 的5 對引物；采用參考文獻中的反應體系和反應條件進行PCR 擴增；用瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產物的大小。

1.7 LPS-mPCR 分型

按參考文獻[4]中的方法合成針對LPS 基因型L1～L8 的引物；并采用該文獻中的反應體系和反應條件對分離株進行LPS-mPCR 擴增，1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產物。

2 結果與分析

2.1 菌株分離與鑒定

根據菌株的革蘭氏染色、菌落特征以及生化培養(yǎng)結果，依據參考文獻[6]的標準初步判定共分離多殺性巴氏桿菌102 株。

2.2 種特異性PCR 鑒定

初步鑒定為禽Pm 分離株的菌液或菌落PCR 擴增并電泳發(fā)現(xiàn)，擴增產物與預期結果相符，均出現(xiàn)一條460 bp 的條帶（部分菌株的結果見圖1）。這進一步確定本所收集和分離的102 個分離株均為Pm。

2.3 多重莢膜PCR 鑒定

利用多重莢膜PCR 方法將102 個Pm 菌株進行莢膜血清型分型，擴增結果發(fā)現(xiàn)其中92 株Pm 為莢膜A 型，條帶為1 044 bp，10 株無法定型（部分菌株的擴增結果見圖2）。表明該地區(qū)流行的禽Pm以A 型為主。

圖2 部分Pm 菌株莢膜PCR 結果

2.4 LPS-mPCR 分型結果

利用LPS-mPCR 方法對分離的102 個Pm 菌株進行LPS 分型鑒定，結果見圖3。圖3顯示，這些菌株可以分為2 種LPS 型，分別為L1 和L3 型。其中L1 型98 株，L3 型4 株。

圖3 部分Pm 菌株LPS-mPCR 結果

3 討 論

前人對多殺性巴氏桿菌分型進行了諸多研究，其中Carter 用間接血凝實驗將Pm 莢膜型分為A、B、D、E 這4 個血清型，后來又從火雞上鑒定出F型；Townsend 等[5]研究表明，A、B、D、E、F 菌株的生物合成位點的基因分別是hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD 等，針對這幾種莢膜合成基因位點設計引物，擴增出的片段大小分別為1 044、760、657、511、851 bp；由此建立了莢膜分型PCR。1972年Hed dleston 建立的耐熱抗原瓊脂擴散沉淀將Pm 菌株分為16 個（1～16）血清型[7]。通過對Pm 這16 個Heddleston 菌體血清型的脂多糖外核心寡糖的基因和化學結構進行分析，結果表明，僅有8 個特有的脂多糖外核生物合成位點[8]。針對這8 個合成位點建立了脂多糖多重PCR，用于區(qū)分Pm 的LPS 基因型[7]，其中L1 型包括血清型1 和14 型，L3 型包括血清3 和4型。莢膜多重PCR、脂多糖多重PCR 方法的建立逐漸代替之前的繁瑣的血清學方法而應用于Pm 的檢測、鑒定和分型中，本研究也采用這2 種方法對分離的菌株進行莢膜PCR 和脂多糖基因型分型。

本研究從2009-2017年共9年間從江蘇等省份共1 556 份病料樣品中分離102 株Pm 菌株，分離率為6.56%。其中雞分離53 株、鴨分離28 株、鵝分離21 株。所分離的菌株有92 株屬于A 型，有10株未定型；而脂多糖多重PCR 分型結果發(fā)現(xiàn)其中98 個Pm 分離株屬于L1 型，這表明該地區(qū)禽Pm 菌株主要為脂多糖L1 型，對應的菌體血清型為1 型；此外還存在4 株L3 型，對應的血清型為3 或4 型。這與國內其他研究相符合[9]。

調查發(fā)現(xiàn)：禽霍亂的發(fā)病率大幅減低，一般養(yǎng)殖規(guī)模較小，生物安全措施不到位的小型養(yǎng)殖場、養(yǎng)殖戶家禽發(fā)病率較高；禽群中雞、鴨、鵝發(fā)病率均較高，雞發(fā)病多在90～120日齡；發(fā)病季節(jié)以氣候多變的春季和高溫、潮濕、多雨的夏、秋兩季為主。

因為家禽生產上使用的禽霍亂疫苗菌株陳舊，免疫效果不理想，而臨床上接種比例非常低，再加上飼料里普遍添加藥物以及臨床上抗生素的濫用，所以禽霍亂一般與其他疾病混合感染或繼發(fā)感染。這也造成Pm 菌株抗生素耐藥性提高，臨床治療難度增加。根據本研究流行病學調查的結果以及目前國內養(yǎng)殖行業(yè)無抗生產的要求分析，禽霍亂需要全面更新疫苗菌株，采用流行菌株制備動物疫苗，并加強生產管理，采用綜合的生物安全措施來進行防控。