瞿小玲 曾 儀 姚 利 蔡 政

(南陽市中心醫(yī)院產(chǎn)二科，南陽473000)

卵巢癌是導致女性癌癥死亡的第四主要原因，也是死亡率最高的一類女性生殖腫瘤[1]。研究表明，卵巢癌好發(fā)于絕經(jīng)后的女性。但近年來，隨著我國人口老齡化，卵巢癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，并且其好發(fā)人群趨于年輕化[2]。目前，卵巢癌的治療仍以化療為主，但化療僅對早期卵巢癌具有較好療效，化療抵抗性使化療的應用進一步受限[3]。大量研究表明，自噬是癌細胞化療抵抗性形成的主要機制[4]。抑制自噬可降低卵巢癌細胞的化療抵抗性，促進癌細胞死亡，從而減緩癌癥的發(fā)展[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)草本藥物尤其是植物揮發(fā)油在治療癌癥方面具有較大的優(yōu)勢[6]。檜木醇是提取自臺灣扁柏的一類單貼類化合物，是扁柏精油的主要有效成分，具有抗菌及抗腫瘤活性[7]。Wang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，檜木醇能誘導乳腺癌和結(jié)腸癌細胞自噬性死亡，抑制癌細胞增殖，提示檜木醇能調(diào)控癌細胞自噬。但檜木醇對卵巢癌細胞自噬的作用尚未見報道。因此，本文以卵巢癌SKOV3細胞為研究對象，探究檜木醇對卵巢癌細胞自噬的作用及機制，以期為卵巢癌的治療提供新的潛力藥物。

1 材料與方法

1.1材料 DMEM細胞培養(yǎng)液、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶購自美國Hyclone公司。檜木醇購自美國Sigma公司，純度 ≥ 99%。RIPA裂解液、CCK8試劑盒和BCA試劑盒購自北京索萊寶生物科技公司。Annexin-FITC/PI試劑盒購自上海銳賽生物技術(shù)有限公司。Beclin1、P62、LC3、雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin,mTOR) 和UNC-51樣激酶(UNC-51 like kinase 1,Ulk1)一抗購自美國Millipore公司，山羊抗小鼠和山羊抗兔二抗購自北京康為生物科技公司。人卵巢癌細胞株SKOV3來源于中國科學院上海細胞庫。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)SKOV3細胞，隔天換液，2～3 d進行傳代。

1.2.2細胞分組及處理 將細胞以3×104個/ml的密度接種于培養(yǎng)板中，分為SKOV3組、Hinokitiol (5 μmol/L) 組、Hinokitiol (10 μmol/L) 組和Hinokitiol (20 μmol/L) 組，每組至少3個復孔。培養(yǎng)24 h后，并分別用0、5、10、20 μmol/L的檜木醇處理細胞24 h后進行檢測。

1.2.3CCK8檢測細胞活性 將細胞以1×104個/ml的密度接種于96孔板中，并分為SKOV3組、Hinokitiol (5 μmol/L) 組、Hinokitiol (10 μmol/L) 組和Hinokitiol (20 μmol/L) 組，每組6個復孔。待細胞貼壁后，用不同濃度的檜木醇分別處理細胞0、1、2、3、4 d。每孔加入10 μl的CCK8溶液，2 h后用酶標儀檢測各組細胞吸光度，計算細胞增殖倍數(shù) (增殖倍數(shù)=細胞吸光度/0 h細胞吸光度)。

1.2.4克隆實驗檢測細胞增殖 收集細胞，將細胞分為SKOV3組、Hinokitiol (5 μmol/L) 組、Hinokitiol (10 μmol/L) 組和Hinokitiol (20 μmol/L) 組，用含有不同濃度檜木醇的培養(yǎng)液將細胞重懸后接種于培養(yǎng)皿中，使每個培養(yǎng)皿的細胞數(shù)為200個。將細胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周，有集落形成后終止培養(yǎng)，用甲醇固定細胞，用結(jié)晶紫對細胞染色，統(tǒng)計形成集落細胞數(shù)。

1.2.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 將細胞用不同濃度檜木醇處理后，用0.25%胰酶收集細胞，將細胞密度調(diào)整為1×106個/ml，隨后根據(jù)Annexin-FITC/PI細胞凋亡試劑盒說明書檢測各組細胞凋亡率。

1.2.6免疫印跡檢測蛋白表達 用RIPA裂解液提取各組細胞蛋白，并用BCA試劑盒檢測各組細胞蛋白濃度。每組各取30 μg蛋白用10% SDS-PAGE進行分離，用半干法轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到PVDF膜。用緩沖液清洗PVDF膜3次，加入5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。2 h后加入適宜濃度一抗4℃封閉過夜。第2天洗去未結(jié)合一抗，加入二抗室溫孵育1 h后，加入化學發(fā)光顯色液曝光顯影。Image J軟件對蛋白質(zhì)條帶灰度值進行定量分析。

1.2.7免疫熒光檢測LC3表達 將細胞用不同濃度檜木醇處理后，加入磷酸鹽緩沖液清洗3次。隨后加入4%多聚甲醛室溫固定30 min，用0.5% TritonX-100對細胞膜穿孔。用磷酸鹽緩沖液洗去TritonX-100后，加入10%的封閉用山羊血清室溫封閉2 h，隨后滴加LC3一抗 (1∶300) 于4℃封閉過夜。第2天洗去細胞表面一抗，加入GFP標記山羊抗兔二抗(1∶250) 室溫避光孵育1 h后洗凈，滴加DAPI染色液對細胞核染色。于熒光顯微鏡下觀察LC3表達情況。

2 結(jié)果

2.1檜木醇對卵巢癌細胞增殖的影響 CCK8實驗結(jié)果 (圖1) 表明，檜木醇處理細胞4 d后，Hinokitol (5、10、20 μmol/L) 組細胞增殖倍數(shù)與SKOV3組比較明顯降低 (P<0.05,P<0.01)；同時，Hinokitol (5、10、20 μmol/L) 組克隆形成細胞數(shù)明顯減少(P<0.05,P<0.01，圖2)，與SKOV3組比較差異有統(tǒng)計學意義，表明檜木醇能抑制卵巢癌SKOV3細胞增殖。

2.2檜木醇對卵巢癌細胞凋亡的影響 與SKOV3組比較，Hinokitiol(5、10、20 μmol/L)組細胞凋亡率均顯著升高 (P<0.05,P<0.01，圖3)，并具有量效關(guān)系，表明檜木醇能誘導卵巢癌SKOV3細胞凋亡。

2.3檜木醇對卵巢癌細胞自噬的影響 如圖4所示，與SKOV3組比較，Hinokitol(5、10、20 μmol/L) 組細胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值明顯降低 (P<0.05,P<0.01)，P62蛋白表達明顯水平明顯升高(P<0.05,P<0.01)；同時，Hinokitol(5、10、20 μmol/L) 還能顯著減少LC3在細胞質(zhì)中的陽性表達(P<0.01，圖5)，表明檜木醇能抑制卵巢癌SKOV3細胞自噬。

2.4檜木醇對卵巢癌細胞mTOR信號通路的影響 免疫印跡實驗結(jié)果 (圖6) 表明，檜木醇濃度為5、10、20 μmol/L時均能顯著促進SKOV3細胞mTOR蛋白表達 (P<0.01)，降低Ulk1的蛋白表達水平 (P<0.05,P<0.01)，并隨濃度升高，作用逐漸增強，表明檜木醇能誘導mTOR信號通路激活。

圖1 檜木醇對SKOV3細胞增殖的影響Fig.1 Cell proliferation was detected by CCK8 assay after treated by hinokitiol in SKOV3 cellsNote: Cell viability was measured by CCK8 assay.Data are expressed as the vs SKOV3 group.

圖2 檜木醇對SKOV3細胞克隆形成的影響Fig.2 Cell colon formation was detected by crystal violet staining after treated by hinokitiol in SKOV3 cellsNote: The proliferation of SKOV3 cells was determined by colon formation assay.Data are expressed as the vs SKOV3 group.

圖3 檜木醇對SKVO3細胞凋亡的影響Fig.3 Cell apoptosis was detected by flow cytometry after treated by hinokitiol in SKOV3 cellsNote: Cell apoptosis was measured by flow cytometry.Data are expressed as the vs SKOV3 group.

圖4 檜木醇對LC3、Beclin1和P62表達的影響Fig.4 Expression of autophagy factors were detected after treated by hinokitiol in SKOV3 cellsNote: LC3,Beclin1 and P62 were detected using Western blot analysis.Data are expressed as vs SKOV3 group.

圖5 檜木醇對LC3在細胞質(zhì)中表達的影響Fig.5 Distribution of LC3 in SKOV3 cells after treated by hinokitiolNote: Immunofluorescence was performed for expression of LC3.Data are expressed as the vs SKOV3 group.

圖6 檜木醇對mTOR信號通路的影響Fig.6 Activation of mTOR signaling pathway factors were detected by Western blotNote: mTOR and Ulk1 were measured by Western blot.Data are expressed as the vs SKOV3 group.

3 討論

卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤之一，由于早期的無癥狀表現(xiàn)、化療抵抗性和高復發(fā)率導致卵巢癌患者死亡率居高不下[9]。檜木醇是一類天然產(chǎn)物提取物。研究表明，檜木醇在抗炎、抗菌、抗真菌和抗病毒方面具有較強活性，同時還能抑制多種癌細胞細胞系增殖，如黑色素瘤、前列腺癌、口腔癌和結(jié)腸癌等[10]。大量研究表明，檜木醇對癌細胞生長抑制的有效濃度為5～800 μmol/L[11,12]?？紤]到檜木醇的生物利用率和抑癌活性，本研究選擇了5、10、20 μmol/L 3個濃度進行試驗。結(jié)果表明，檜木醇還能明顯抑制卵巢癌細胞生長，降低卵巢癌細胞SKOV3的增殖倍數(shù)，減少集落形成細胞數(shù)。同時，檜木醇還能升高卵巢癌SKOV3細胞凋亡率。癌細胞凋亡抑制是癌癥發(fā)生和發(fā)展的機制之一，通過誘導癌細胞凋亡以減緩癌癥的病理進程[13]。提示檜木醇能通過抑制卵巢癌SKOV3細胞增殖、誘導癌細胞凋亡來抑制卵巢癌的發(fā)展。

自噬是真核細胞內(nèi)的降解自身受損細胞器及細胞質(zhì)蛋白質(zhì)的過程，在維持體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定過程中發(fā)揮著重要作用[14]。在營養(yǎng)缺乏等應激條件下，機體可通過自噬重新利用蛋白質(zhì)和脂肪降解后的營養(yǎng)物維持細胞存活[15]。研究表明，自噬在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要調(diào)控作用。在癌癥發(fā)生初期，自噬能通過抑制癌變基因的表達抑制腫瘤形成[16]。但在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中，自噬可通過為腫瘤組織血管新生提供營養(yǎng)物質(zhì)和抵抗藥物對癌細胞的毒性促進癌癥發(fā)展[17,18]。誘導自噬可促進卵巢癌對藥物順鉑化療抵抗的形成[19]。因此，近年來自噬被認為是癌癥治療的靶標之一。自噬始于自噬小體的形成，LC3是自噬小體雙膜形成和延伸的重要蛋白，因此其在細胞膜上的表達被作為自噬小體形成的標志[20]。Beclin1也是自噬小體形成的重要蛋白之一，主要負責自噬小體形成相關(guān)蛋白的招募，同時還能通過誘導抗凋亡蛋白Bcl-2表達抑制癌細胞凋亡，敲除Beclin1基因能增加小鼠卵巢癌的發(fā)病率[21]。自噬小體形成后會與溶酶體結(jié)合，形成自溶酶體，在P62等蛋白質(zhì)的參與下被溶酶體催化酶催化降解[22]。本文采用免疫印跡及免疫熒光檢測LC3、Beclin1和P62在卵巢癌SKOV3細胞中的表達，探究檜木醇對卵巢癌細胞自噬的影響。結(jié)果表明，檜木醇能顯著降低SKOV3細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和 Beclin1的蛋白表達水平，并誘導P62表達。同時，免疫熒光結(jié)果表明，LC3在細胞膜的陽性表達明顯減少。以上結(jié)果均表明，檜木醇能抑制卵巢癌SKOV3細胞自噬，從而抑制癌細胞增殖、誘導細胞凋亡。

mTOR信號通路是調(diào)控自噬的經(jīng)典通路之一，自噬激活依賴于mTOR表達抑制。mTOR活性抑制可誘導ULK1蛋白磷酸化，促進LC3、Beclin1等自噬蛋白的招募，誘導自噬的發(fā)生[23]。研究表明，順鉑和氯喹聯(lián)合用藥可通過抑制腺苷酸激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)活化促進mTOR磷酸化，從而抑制自噬，增強癌細胞對順鉑敏感性，減緩癌癥發(fā)展[24]；此外趙敏等[25]研究者也證明丹酚酸B可以通過mTOR/Ulk1信號通路誘導膠質(zhì)瘤細胞自噬性死亡；詹慧芳等[26]也證明雷帕霉素可通過抑制mTOR/4E結(jié)合蛋白1(4E binding protein 1,4EBP1)激活自噬以改善過氧乙酰硝酸酯(Peroxyacetyl nitrate,PAN)誘導的足細胞損傷。本文研究發(fā)現(xiàn)，檜木醇能顯著升高mTOR表達水平，降低Ulk1表達水平，表明檜木醇可調(diào)控卵巢癌SKOV3細胞mTOR信號通路的激活。

綜上所述，檜木醇能降低卵巢癌SKOV3細胞增殖倍數(shù)，抑制細胞克隆形成并誘導細胞凋亡，同時，檜木醇還能降低LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和 Beclin1的蛋白表達水平，促進P62表達，并誘導LC3在細胞膜表達；此外，檜木醇還能升高mTOR表達水平，降低Ulk1表達水平，表明檜木醇能抑制卵巢癌SKOV3細胞自噬，從而抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡，作用機制與調(diào)控mTOR通路激活有關(guān)。本文研究首次探究了檜木醇對卵巢癌細胞增殖、凋亡及自噬的作用，為卵巢癌的治療提供了新的潛力藥物。